Nrf2-GPX4介導的鐵死亡通路參與右美托咪定對腦出血大鼠神經保護作用的機制研究

李秋暢，閆順昌，蒙亞珍，顧云霞，寧巧明，李娜，王志華

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一種具有高病死率的腦卒中亞型，老年患者居多，目前仍缺乏有效治療方法［1］。研究發現，當ICH發生時，鐵會在血腫周圍積累，而過量的鐵積累可造成氧化應激，損傷細胞膜、蛋白質及DNA，從而對細胞功能造成嚴重破壞，導致神經細胞死亡［2-3］。降低ICH后鐵積累造成的鐵死亡發生，對ICH 的治療至關重要。目前針對該方面的藥物研究十分有限。核因子E2相關因子2/谷胱甘肽過氧化物酶4（nuclear factor erythroid-2 related factor 2/glutathione peroxidase 4，Nrf2/GPX4）是一個與鐵死亡相關的抗氧化途徑。研究表明，激活該途徑可減少鐵積累，從而緩解腦損傷后鐵死亡造成的神經損傷［4］。右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）為臨床實踐中常用麻醉輔助劑，是α2腎上腺素能受體激動劑，具有高度特異性，可作用于藍斑從而產生抗焦慮、鎮靜的作用，在ICH時可以進行神經保護［5-6］。但其對ICH 的神經保護作用是否與鐵死亡有關還不清楚。本研究通過構建ICH 大鼠模型，基于Nrf2-GPX4 介導的鐵死亡通路探究Dex 對ICH 大鼠的神經保護作用，以期為針對ICH鐵死亡相關新藥的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級SD 大鼠100 只，體質量190～230 g，40～45日齡，購自中國醫學科學院醫學生物學研究所。大鼠恒溫飼養7 d，以適應環境（12 h晝夜交替），飼養期間自由進食及飲水，許可證號：SCXK（滇）K2019-0002。

1.2 試劑和儀器 右美托咪定（國藥準字H20133331，1 mL∶0.1 mg，江蘇恩華藥業）；ML385（CSN22320-5 mg，CSNpharm，Inc.）；丙二醛（malonaldehyde，MDA）、鐵離子、谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒（E2019、E1042-100/300、E2015，北京普利萊）；HE 染色試劑盒（DH0006，北京雷根生物）；BCA 試劑盒（LCB004，上海榕柏生物）；兔抗Nrf2、βactin、GPX4、胱氨酸/谷氨酸逆向轉運蛋白（Cystine/glutamate antiporter system light chain，xCT）抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗（SA00001-2、16396-1-AP、60008-1-Ig、14432-1-AP、26864-1-AP、SA00001-2，Proteintech）；Nissl 染色液（KGMP0185，江蘇凱基生物）；普魯士藍染色試劑盒（SOS-939，北京凱詩源生物）；UVP Gelstudio PLUS touch凝膠成像儀（德國耶拿）；JC-1086A酶標儀（青島聚創環保集團）；Talos F200C TEM透射電子顯微鏡（北京歐波同光學技術）。

1.3 研究方法

1.3.1 分組和ICH 模型建立 采用隨機數字表法將大鼠分成Sham組、ICH組（模型組）、Dex-L組（Dex 50 μg/kg）、Dex-H組（Dex 100 μg/kg）［7］和Dex-H+ML385組（Nrf2抑制劑ML385 30 mg/kg）［8］，每組20只。除Sham組外，其余組通過自體血注射法進行ICH 模型建立：大鼠腹腔注射3 mL/kg 水合氯醛（10%）進行麻醉后俯臥位固定，消毒后于前囟旁（3 mm）縱向開口（10 mm），切開頭皮暴露前囟，于前囟后方1 mm、側方3 mm 處鉆孔，于右側尾狀核處注入50 μL 自體尾靜脈血（10 min 內）后留針5 min，退針、縫合開口，Sham 組于相同位置注入生理鹽水（50 μL）［9］，2 h后若Zea Longa 評分為1～3分則造模成功［10］。Dex-L 組、Dex-H 組、Dex-H+ML385 組于術前30 min腹腔注射相應Dex或ML385，Sham組和ICH組則注射等量的生理鹽水。

1.3.2 神經功能缺損評分 于術后2 h 使用Zea Longa 評分法評定大鼠神經功能：無神經損傷記0分；對側前爪無法伸直記1分；對側轉圈記2分；對側傾倒記3分；自發行走障礙或者意識喪失記4分［9］。

1.3.3 GSH、MDA、鐵離子含量檢測 術后24 h，每組隨機抽取5只大鼠進行頸椎脫臼處死，斷頭取出腦組織后分離血腫周圍腦組織并置于研缽中進行勻漿、離心。通過比色法對一部分上清液進行GSH、MDA、鐵離子含量的測定，其余部分用于Western blot。

1.3.4 大鼠血腫周圍腦含水量檢測 每組另隨機抽取5只大鼠大腦血腫周圍組織稱質量，60 ℃烘烤48 h，于腦質量恒定后稱取干質量，腦組織含水量=（濕質量-干質量）/濕質量×100%，重復5次。

1.3.5 HE染色對血腫周圍腦組織進行病理學檢測 每組再次隨機抽取5只大鼠，取其腦組織，一部分使用多聚甲醛浸泡將其固定，脫水、石蠟包埋并切片（4 μm），行HE染色后光鏡檢測腦組織病理學；另一部分行Nissl染色。

1.3.6 Nissl 染色觀察大鼠血腫周圍腦組織神經細胞損傷情況 將1.3.5所余另一部分腦組織進行冷凍后制作冰凍切片（5 μm），經過二甲苯脫蠟后使用無水乙醇脫水，滴加焦油紫溶液（0.1%）染色及鹽酸-乙醇分色后依次進行脫水、透明和封片，于400 倍顯微鏡下隨機讀取血腫周圍大腦皮層5 個視野觀察神經細胞數量（n=5）。

1.3.7 普魯士藍染色檢測血腫周圍腦組織中鐵沉積 取每組剩余的5 只大鼠腦組織制成常規切片，進行60 s 的蒸餾水沖洗，Perls 染色40 min 后再次沖洗，核固紅試劑核染10 min后脫水透明、封片并風干，于光鏡下觀察藍色鐵沉積。

1.3.8 Western blot 檢測腦組織GPX4、xCT、Nrf2 表達取1.3.3剩余上清液蛋白，BCA法對其定量，蛋白上樣進行SDSPAGE 電泳，將蛋白轉移到PVDF 膜后脫脂牛奶（5%）進行封閉，過夜（4 ℃）孵育GPX4、xCT、Nrf2、β-actin抗體（1∶1 000），次日孵育HRP-IgG二抗（1∶2 000），120 min后ECL顯色曝光，Image Lab軟件分析計算GPX4、xCT、Nrf2的相對表達水平。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0 及GraphPad Prism 7 軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，多組比較行one-way ANOVA 檢驗，組間多重比較行LSD-t法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 Sham 組、ICH 組、Dex-L 組、Dex-H 組、Dex-H+ML385 組神經功能缺損評分分別為（0.00±0.00）、（2.54±0.46）、（1.30±0.29）、（0.44±0.07）、（1.64±0.41）分，組間比較差異有統計學意義（F=214.184，P＜0.01）；相較于Sham 組，ICH 組明顯增加；相較于ICH 組，Dex-L 組與Dex-H 組依次明顯降低；相較于Dex-H 組，Dex-H+ML385組明顯增加（均P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腦組織GSH、MDA、鐵離子含量比較 相較于Sham組，ICH組MDA、鐵離子含量增加，GSH含量減少；相較于ICH組，Dex-L組與Dex-H組MDA、鐵離子含量依次減少，GSH 含量增加；相較于Dex-H組，Dex-H+ML385組MDA、鐵離子含量增加，GSH含量減少（均P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of iron ion,MDA and GSH content in brain tissue of rats between the five groups表1 各組大鼠腦組織鐵離子、MDA、GSH含量比較 （n=5，±s）

Tab.1 Comparison of iron ion,MDA and GSH content in brain tissue of rats between the five groups表1 各組大鼠腦組織鐵離子、MDA、GSH含量比較 （n=5，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham 組比較，b與ICH 組比較，c與Dex-L 組比較，d與Dex-H組比較，P＜0.05；表2同。

2.3 各組大鼠血腫周圍腦組織含水量比較 Sham組、ICH組、Dex-L組、Dex-H組、Dex-H+ML385組腦含水量分別為（61.82±6.95）%、（87.22±7.83）%、（76.04±6.01）%、（63.10±6.12）%、（81.09±6.94）%，組間比較差異有統計學意義（F=13.406，P＜0.05）；相比Sham 組，ICH 組的腦含水量明顯增加；相比ICH組，Dex-L組與Dex-H組的腦含水量明顯減少；相比Dex-H 組，Dex-H+ML385 組的腦含水量明顯增加（均P＜0.05）。

2.4 各組大鼠腦組織病理情況變化 Sham 組腦組織結構未見異常；ICH組血腫周圍腦組織炎性浸潤、壞死及水腫現象嚴重，神經細胞呈疏松且不規則排列；相比ICH 組，Dex-L 組與Dex-H 組的細胞水腫、壞死及炎性浸潤現象明顯減輕，細胞間隙減??；相比Dex-H 組，Dex-H+ML385組上述損傷現象進一步加重，見圖1。

2.5 各組大鼠腦組織神經細胞損傷情況比較 Sham組神經細胞形態正常且結構完整，存在大量尼氏體，未發現異?，F象；ICH 組神經細胞稀疏、紊亂，壞死嚴重，尼氏體數量明顯減少；相比ICH 組，Dex-L 組與Dex-H 組的神經細胞層次豐富、緊密排列且壞死減少，尼氏體增多；相比Dex-H組，Dex-H+ML385組神經細胞損傷明顯加重，見圖2。Sham 組、ICH 組、Dex-L組、Dex-H組、Dex-H+ML385組神經細胞數分別 為（92.46±5.92）、（20.46±4.20）、（38.79±5.05）、（62.35±5.47）、（35.67±4.53）個/視野，組間比較差異有統計學意義（F=153.491，P＜0.01）；相比Sham 組，腦組織神經細胞數在ICH組明顯減少；相比ICH組，Dex-L 組與Dex-H 組的神經細胞數依次明顯增加；相比Dex-H組，Dex-H+ML385組的神經細胞數明顯減少（均P＜0.05），見圖2。

2.6 各組大鼠腦組織鐵沉積比較 Sham 組腦組織中未觀察到鐵沉積現象；相比Sham 組，ICH 組鐵沉積增多；相比ICH組，Dex-L組與Dex-H組鐵沉積依次減少；相比Dex-H 組，Dex-H+ML385 組鐵沉積增多，見圖3。

2.7 各組大鼠腦組織GPX4、xCT、Nrf2 蛋白表達水平比較 相比Sham 組，ICH 組的GPX4、xCT、Nrf2 表達水平降低；相比ICH 組，Dex-L 組與Dex-H 組的GPX4、xCT、Nrf2表達水平依次升高；相比Dex-H組，Dex-H+ML385組GPX4、xCT、Nrf2表達水平降低（均P＜0.05），見表2、圖4。

3 討論

ICH 屬于腦卒中急性亞型，約占出血性卒中的80%；導致ICH 患者預后不良的是神經細胞損傷的復雜病理過程，而鐵積累則被證明是導致腦水腫及神經細胞發生不可逆損傷的主要原因之一，因此抑制鐵死亡可保護神經細胞［11-12］。然而，ICH 后鐵死亡發生的具體機制尚未闡明。

Fig.1 Pathological changes of brain tissue in each group(HE staining,×400)圖1 各組大鼠腦組織病理情況變化（HE染色，×400）

Fig.2 Comparison of nerve cell damage in brain tissue of rats between the five groups (Nissl staining,×400)圖2 各組大鼠腦組織神經細胞損傷情況比較（Nissl染色，×400）

Fig.3 Comparison of iron deposition in brain tissue of rats between the five groups (Prussian blue staining,×400)圖3 各組大鼠腦組織鐵沉積比較（普魯士藍染色，×400）

Tab.2 Comparison of the expression levels of GPX4,xCT and Nrf2 in brain tissue of rats between the five groups表2 各組大鼠腦組織GPX4、xCT、Nrf2表達水平比較 （n=5，±s）

Tab.2 Comparison of the expression levels of GPX4,xCT and Nrf2 in brain tissue of rats between the five groups表2 各組大鼠腦組織GPX4、xCT、Nrf2表達水平比較 （n=5，±s）

Fig.4 Comparison of the expression levels of GPX4,xCT and Nrf2 in brain tissue of rats between the five groups圖4 各組大鼠腦組織GPX4、xCT、Nrf2蛋白表達水平比較

α2 腎上腺素受體激動劑Dex 是一種具有催眠、鎮靜作用的咪唑衍生物，α2腎上腺素受體廣泛分布于周圍神經系統、中樞神經系統及自主神經節中。大量證據表明，Dex可以通過抗氧化、抑制細胞凋亡或影響細胞信號通路等多種機制對神經起保護作用，也對ICH、腦缺血再灌注損傷等具有顯著的改善作用［7，13］。Dex 可通過抑制炎癥小體的激活來減輕腦組織炎癥損傷，保護ICH 后血腦屏障［14］。Dex 在ICH小鼠中可通過抑制由線粒體功能障礙造成的氧化應激來改善神經功能缺損［6］。Dex在SK-N-SH神經細胞中可通過抑制叔丁基氫過氧化物誘導的鐵積累來改善細胞氧化損傷［15］。另有研究發現，100 μg/kg Dex對腦缺血再灌注大鼠神經功能具有明顯的保護作用［7］。因此，本研究使用50、100 μg/kg Dex 處理ICH大鼠，發現Dex可顯著降低ICH大鼠神經功能缺損評分、MDA、鐵離子含量、腦含水量、腦組織病理損傷、鐵沉積，增加GSH 含量、神經細胞數，其改善程度隨Dex 含量的升高而更為顯著。該結果表明，Dex 具有抑制ICH 大鼠腦組織氧化損傷及鐵積累，改善神經功能的作用。

內源性抗氧化酶GPX4 可使脂質過氧化物轉化為無毒的脂質，以此起到抵抗脂質過氧化的作用，從而抑制鐵死亡；GSH作為合成GPX4所必要的底物，起到輔助GPX4 發揮抗氧化功能的作用，已被認為是調節鐵死亡的關鍵因子［11，16］。研究發現，Nrf2 可通過促進xCT、GSH 及GPX4 表達來抵抗鐵死亡［17］。在非壓力條件下，Nrf2 主要與Kelch 樣ECH 相關蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）相結合，當氧化應激發生時，Keap1被降解后與Nrf2分離，后者進入胞核中啟動抗氧化基因轉錄［17-18］。Nrf2-Keap1蛋白復合物由于可調節細胞抗氧化反應并減輕氧化應激，調節脂質代謝和鐵/血紅素代謝，因此可作為鐵死亡抑制劑［17，19］。GPX4 通過介導鐵死亡來促進ICH 后繼發性腦損傷，而抑制鐵死亡或GPX4 表達可改善ICH 造成的腦損傷［20］。本研究發現，Dex 可顯著增加ICH 大鼠GPX4、xCT、Nrf2 表達水平，并在ICH 大鼠中可有效激活Nrf2-GPX4 信號通路。本研究還顯示，Nrf2 抑制劑ML385 可逆轉Dex 對ICH 大鼠腦組織氧化損傷及鐵積累的抑制，以及對神經功能的改善。因此，本研究不僅為ICH后鐵死亡機制的研究提供參考，對于相應藥物的開發也具有重要意義。但本研究僅限于體內，今后尚需進行體外研究以豐富研究內容。