腸內(nèi)外免疫營(yíng)養(yǎng)對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠機(jī)體免疫功能的影響

韓智君，穆扎帕·依米提，迪米拉·阿里根，帕爾哈提·阿不都熱衣木

重癥急性胰腺炎（Severe Acute Pancreatitis，SAP）是指胰酶在胰腺內(nèi)被激活后引起胰腺組織自身消化的急性化學(xué)性炎癥，具有起病迅急、病情重、并發(fā)癥多、病死率高等特點(diǎn)[1]。近年來(lái)營(yíng)養(yǎng)支持作為一種非手術(shù)治療方法臨床應(yīng)用較多[2]，常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)支持方法包括腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)支持[3]（Enteral Mutrition，EN）和腸外營(yíng)養(yǎng)支持（Parenteral Nutrition，PN）。腸外營(yíng)養(yǎng)是臨床常用的方法，刺激性小且符合SAP高代謝要求；腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)可刺激SAP患者腸黏膜細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)腸道功能恢復(fù)，保持腸黏膜結(jié)構(gòu)完整[4]。免疫營(yíng)養(yǎng)是在普通營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)上添加免疫營(yíng)養(yǎng)素后可以針對(duì)炎性反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)不良、代謝異常、免疫失衡等方面改善患者的營(yíng)養(yǎng)、代謝和免疫狀態(tài)[5]。由此，本研究構(gòu)建大鼠SAP模型，并給予適當(dāng)?shù)哪c內(nèi)、腸外免疫營(yíng)養(yǎng)配方，對(duì)比腸內(nèi)、腸外免疫營(yíng)養(yǎng)治療對(duì)SAP大鼠腸屏障的作用，并初步解析其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取清潔級(jí)SD雄性大鼠，共48只，8~12 W，體重200~240 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組、腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)組、普通腸外營(yíng)養(yǎng)組和腸外免疫營(yíng)養(yǎng)組，每組8只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑與儀器 內(nèi)毒素試劑盒、FITCConjugated Mouse anti-Rat CD4 monoclonal antibody、PEConjugated Mouse anti-Rat CD8 monoclonal antibody、大鼠分泌型免疫球蛋白（SIgA）、白細(xì)胞介素10（IL-10）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、ELISA檢測(cè)試劑盒、流式細(xì)胞儀BD FACSCantoTMⅡ（Becton-Dickinson）、倒置熒光顯微鏡、低速離心機(jī)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、酶標(biāo)儀。

1.2 建立動(dòng)物模型、分組 根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]建立大鼠SAP模型。假手術(shù)組：切開(kāi)腹腔后，不注射牛磺膽酸鈉，輕翻胰腺后縫合切口。將建立模型的大鼠隨機(jī)分為模型組、普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組、腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)組、普通腸外營(yíng)養(yǎng)組和腸外免疫營(yíng)養(yǎng)組。模型組大鼠腹腔注射生理鹽水。普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組：建模24 h內(nèi)，經(jīng)空腸勻速輸入平衡液，建模24 h后，給予瑞素。腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)組：在瑞素中加入谷氨酰胺（24.15 g/kg）、精氨酸（11.63 g/kg）和ω-3脂肪酸（3 g/kg）。普通腸外營(yíng)養(yǎng)組：建模24 h內(nèi)，經(jīng)頸內(nèi)靜脈勻速輸入平衡液，建模24 h后，給予每100 ml含7%凡命、20% 英脫利匹特、50%葡萄糖溶液、7 ml力肽、0.4 ml注射用水溶性維生素（Soluvit）、0.4 ml多種微量元素注射液(Ⅱ)（Addamel）和0.4 ml脂溶性維生素注射液(Ⅱ)（Vitalipid）以及22 ml平衡液。腸外免疫營(yíng)養(yǎng)組：在普通腸外營(yíng)養(yǎng)的基礎(chǔ)上按1.5 ml/kg加入L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（L-alanyl-L-glutamine, LALG）后立即輸入。連續(xù)給藥3 d。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）檢測(cè)各組大鼠小腸黏液SIgA含量及血漿IL-10、IL-6表達(dá)水平 處理結(jié)束后麻醉處死大鼠并采用腹主動(dòng)脈取血5 ml，將血液置于肝素抗凝管中，2 500 r/min離心15 min，取血漿，采用ELISA檢測(cè)各組大鼠血漿IL-10、IL-6的表達(dá)水平。剪取空回腸縱行剖開(kāi)，用玻片刮取大鼠腸黏液，加入l ml濃度為0.01 mol/L的PBS緩沖液，30 000 r/min離心10 min，取上清，采用ELISA檢測(cè)大鼠腸黏液SIgA含量。

1.4 HE染色檢查胰腺組織病理學(xué)改變 麻醉處死大鼠取胰腺，用生理鹽水沖洗，15%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片（4 μm），蘇木素染色液染色3~10 min，光鏡下觀察胰腺組織的病理改變。

1.5 各組大鼠血漿內(nèi)毒素檢測(cè) 采用無(wú)熱原肝素鈉采血管采集腹主動(dòng)脈血5 ml，2 500 r/min離心15 min，取血漿，按照內(nèi)毒素試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T淋巴細(xì)胞 在專用試管中加入大鼠外周血標(biāo)本100 μl，分別加入異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的CD4單克隆抗體和FITC標(biāo)記的CD8單克隆抗體5 μl，然后充分混勻，室溫下避光孵育15 min，然后每管加入紅細(xì)胞裂解液2 ml充分混勻，室溫避光下溶血10 min，1 500 r/min離心10 min，棄上清，PBS洗滌后采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組大鼠occludin mRNA表達(dá)水平 取小腸組織約2 g，加入TRIZOL試劑后進(jìn)行勻漿。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，取2 μl cDNA為模板，配制25 μl Realtime PCR反應(yīng)體系，具體反應(yīng)體系參照試劑盒說(shuō)明書，95℃預(yù)變性15 min，95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH） 為 內(nèi) 參， 采 用2-△△Ct法 計(jì) 算。occludin引物為：上游5’-ACGGTGCCATAGAATGAGATGTTG-3'，下 游5’-CAGCTAGTTGTTCATTTCTGCACCA-3'；GAPDH引 物 為： 上 游5’-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3’， 下 游5’-AGATCCACAACGGATACATT-3’。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用表示，采用單因素方差分析對(duì)多樣本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)一步兩兩比較采用最小顯著性差異法（Least-Significant Difference，LSD-t）檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠小腸黏液SIgA含量及血漿IL-6、IL-10表達(dá)水平 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠IL-6表達(dá)水平均顯著升高而小腸黏液SIgA含量、IL-10表達(dá)水平降低（P<0.05）；與模型組相比，各治療組大鼠IL-6表達(dá)水平均降低而SIgA含量、IL-10表達(dá)水平升高（P均<0.05）；與普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組和普通腸外營(yíng)養(yǎng)組相比，腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)組和腸外免疫營(yíng)養(yǎng)組IL-6表達(dá)水平均有不同程度降低而SIgA含量、IL-10表達(dá)水平均升高（P均<0.05）；與腸外免疫營(yíng)養(yǎng)組相比，腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)組IL-6表達(dá)水平更低而SIgA含量、IL-10表達(dá)水平更高（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠 SIgA含量及血漿IL-6、IL-10表達(dá)水平比較（±s，n=48）

表1 各組大鼠 SIgA含量及血漿IL-6、IL-10表達(dá)水平比較（±s，n=48）

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組比較，cP<0.05；與普通腸外營(yíng)養(yǎng)組比較，dP<0.05；與腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)組比較，eP<0.05

組別 SIgA/（μg/ml） IL-6/（pg/ml） IL-10/（pg/ml）假手術(shù)組 101.60±6.46 10.92±1.95 89.05±4.91模型組 37.37±2.68a 153.08±6.49a 15.85±1.52a普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組 62.77±3.66ab 86.60±7.40ab 38.31±2.64ab腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)組 92.91±3.37abc 49.91±2.34abc 70.38±2.93abc普通腸外營(yíng)養(yǎng)組 63.14±2.29ab 86.81±5.99ab 38.85±3.20ab腸外免疫營(yíng)養(yǎng)組 88.05±4.94abde 53.78±3.31abde 66.82±3.87abde F值 269.736 724.230 512.694 P值 <0.05 <0.05 <0.05

2.2 各組大鼠胰腺組織病理形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組大鼠胰腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，包膜完整。模型組大鼠出現(xiàn)廣泛凝固性壞死，間質(zhì)水腫明顯，大量單核和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組和普通腸外營(yíng)養(yǎng)組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)與模型組相比，較完整，壞死組織較少，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少，病變程度相對(duì)減輕；腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)組和腸外免疫營(yíng)養(yǎng)組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)較普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組和普通腸外營(yíng)養(yǎng)組完整，壞死組織減少，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少，且腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)較腸外免疫營(yíng)養(yǎng)組大鼠更完整。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠胰腺組織病理形態(tài)學(xué)變化（HE染色，×100）

2.3 各組大鼠血漿內(nèi)毒素含量 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血漿內(nèi)毒素含量顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，各治療組大鼠內(nèi)毒素含量均降低（P均<0.05）；與普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組和普通腸外營(yíng)養(yǎng)組相比，腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)組和腸外免疫營(yíng)養(yǎng)組內(nèi)毒素含量均有不同程度降低（P均<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血漿內(nèi)毒素含量（±s，n=48）

表2 各組大鼠血漿內(nèi)毒素含量（±s，n=48）

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組比較，cP<0.05；與普通腸外營(yíng)養(yǎng)組比較，dP<0.05

組別 內(nèi)毒素含量（EU/ml）假手術(shù)組 0.48±0.04模型組 2.45±0.19a普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組 1.46±0.09ab腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)組 0.91±0.16abc普通腸外營(yíng)養(yǎng)組 1.47±0.10ab腸外免疫營(yíng)養(yǎng)組 0.95±0.06abd F值 259.619 P值 <0.05

2.4 各組大鼠外周血CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T淋巴細(xì)胞 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠外周血CD4+T、CD4+T/CD8+T淋巴細(xì)胞均顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，各治療組大鼠CD4+T、CD4+T/CD8+T淋巴細(xì)胞均升高（P均<0.05）；與普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組和普通腸外營(yíng)養(yǎng)組相比，腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)組和腸外免疫營(yíng)養(yǎng)組CD4+T、CD4+T/CD8+T淋巴細(xì)胞均有不同程度升高（P均<0.05）；而各組CD8+T淋巴細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3、圖2。

圖2 各組大鼠外周血CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞

表3 各組大鼠外周血CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T淋巴細(xì)胞比較（±s，n=48）

表3 各組大鼠外周血CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T淋巴細(xì)胞比較（±s，n=48）

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組比較，cP<0.05；與普通腸外營(yíng)養(yǎng)組比較，dP<0.05

組別 CD4+T淋巴細(xì)胞 CD8+T淋巴細(xì)胞CD4+T/CD8+T淋巴細(xì)胞假手術(shù)組 85.37±8.22 32.33±2.30 2.64±0.09模型組 2.77±0.72a 28.37±0.45 0.10±0.03a普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組 56.17±4.61ab 31.03±3.70 1.83±0.26ab腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)組 64.70±3.49abc 28.87±0.81 2.24±0.18abc普通腸外營(yíng)養(yǎng)組 52.83±2.81ab 29.30±3.13 1.81±0.15ab腸外免疫營(yíng)養(yǎng)組 62.27±4.16abd 29.33±1.22 2.13±0.0.21abd F值 107.864 1.305 81.953 P值 <0.05 0.325 <0.05

2.5 各組大鼠小腸粘黏膜occludin mRNA表達(dá)水平 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠小腸黏膜occludin mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，各治療組大鼠occludin mRNA表達(dá)水平升高（P<0.05）；與普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組和普通腸外營(yíng)養(yǎng)組相比，腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)組和腸外免疫營(yíng)養(yǎng)組occludin mRNA表達(dá)水平均有不同程度升高（P<0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠小腸粘膜occludin mRNA半定量表達(dá)水平（±s，n=48）

表4 各組大鼠小腸粘膜occludin mRNA半定量表達(dá)水平（±s，n=48）

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組比較，cP<0.05；與普通腸外營(yíng)養(yǎng)組比較，dP<0.05

組別 occludin mRNA（ng/L）假手術(shù)組 128.54±0.07模型組 27.87±0.12a普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組 53.22±0.37ab腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)組 100.42±5.25abc普通腸外營(yíng)養(yǎng)組 42.67±5.23ab腸外免疫營(yíng)養(yǎng)組 79.54±0.08abd F值 238.882 P值 <0.05

3 討 論

腸道是機(jī)體最大的細(xì)菌存儲(chǔ)所和內(nèi)毒素中心，SAP在急性反應(yīng)期免疫過(guò)激，會(huì)引起腸屏障的損傷，導(dǎo)致大量腸源性內(nèi)毒素釋放入血并激活體內(nèi)炎癥因子，從而促進(jìn)全身炎癥反應(yīng)引起多器官衰竭，免疫異常在SAP病情的發(fā)展中起重要作用[7-8]。有研究表明，腸屏障功能的損傷所引發(fā)內(nèi)毒素及細(xì)菌移位被認(rèn)為是胰腺繼發(fā)感染的重要原因[9]。腸道免疫屏障主要依靠腸黏膜表面黏液及腸腔中的免疫球蛋白（以SIgA為主）和淋巴細(xì)胞，共同完成腸道的局部免疫防御功能[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，SAP大鼠腸黏膜組織中產(chǎn)生了嚴(yán)重的病理?yè)p傷，血清和腸組織中炎癥因子水平升高提示系統(tǒng)性及腸道出現(xiàn)局部炎癥環(huán)境[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在SAP發(fā)生進(jìn)展中，由于循環(huán)血液中腸源性內(nèi)毒素水平升高，導(dǎo)致NF-κB、IL-1β、IL-6、IL-8等多種細(xì)胞炎性因子分泌增加[12-13]。本研究建立SAP大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血漿內(nèi)毒素含量、IL-6表達(dá)水平均顯著升高而小腸黏液SIgA含量、IL-10表達(dá)水平降低；光鏡結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比，模型組大鼠出現(xiàn)廣泛凝固性壞死，間質(zhì)水腫明顯，大量單核和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠外周血CD4+T、CD4+T/CD8+T淋巴細(xì)胞均顯著降低。提示SAP大鼠模型建立成功，大鼠免疫功能被破壞，體內(nèi)炎癥水平及內(nèi)毒素升高，導(dǎo)致腸組織損傷，促進(jìn)SAP發(fā)展。

緊密連接蛋白是腸黏膜機(jī)械屏障重要組成部分，occludin作為腸上皮重要的緊密連接蛋白，主要參與腸壁通透性的調(diào)節(jié)，對(duì)于維護(hù)黏膜屏障的完整性有非常重要的意義[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，occludin蛋白表達(dá)的變化是引起細(xì)菌移位、維持腸黏膜屏障功能的關(guān)鍵[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)相比，模型組大鼠小腸黏膜occludin mRNA表達(dá)水平顯著降低；與模型組相比，各治療組occludin mRNA表達(dá)水平明顯升高。提示SAP大鼠小腸黏膜occludin表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致腸道通透性增高，從而導(dǎo)致內(nèi)毒素等從腸腔中進(jìn)入血液。

目前臨床對(duì)于SAP的治療主要采取營(yíng)養(yǎng)支持治療作為重要的輔助手段。有研究發(fā)現(xiàn)，將腸內(nèi)免疫微生態(tài)營(yíng)養(yǎng)應(yīng)用于重癥急性胰腺炎，有利于維持抗炎反應(yīng)的平衡，實(shí)現(xiàn)對(duì)病情及預(yù)后的改善[17]。另有研究表明，谷氨酰胺增強(qiáng)的腸外營(yíng)養(yǎng)能顯著改善SAP大鼠機(jī)體免疫、降低血漿內(nèi)毒素，有利于細(xì)胞與器官功能的恢復(fù)[18]。本研究采用腸外免疫營(yíng)養(yǎng)和腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行治療并進(jìn)行比較，以分析腸外和腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)對(duì)SAP大鼠腸組織免疫功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組和普通腸外營(yíng)養(yǎng)組相比，腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)組和腸外免疫營(yíng)養(yǎng)組內(nèi)毒素含量、IL-6表達(dá)水平均有不同程度降低而SIgA含量、IL-10表達(dá)水平、CD4+T、CD4+T/CD8+T淋巴細(xì)胞及occludin mRNA表達(dá)均升高；與腸外免疫營(yíng)養(yǎng)組相比，腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)改善更為顯著。提示腸內(nèi)外免疫營(yíng)養(yǎng)支持均可顯著改善SAP。

綜上所述，SAP大鼠小腸黏膜occludin表達(dá)降低導(dǎo)致內(nèi)毒素等從腸腔中進(jìn)入血液，破壞大鼠免疫功能，體內(nèi)炎癥水平升高，導(dǎo)致腸組織損傷；腸內(nèi)外免疫營(yíng)養(yǎng)支持均可顯著改善SAP，但腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)支持在提升SAP大鼠免疫機(jī)能和改善免疫狀態(tài)方面效果優(yōu)于腸外營(yíng)養(yǎng)。