地克珠利在雞蛋中的殘留消除規律研究

霍美霞，孫 磊，侯旖璇，劉海燕，王 磊，黃玲利

(國家獸藥殘留基準實驗室(華中農業大學)，農業農村部食品獸藥殘留檢測重點實驗室(華中農業大學)，農業農村部畜禽產品質量安全風險評估實驗室(武漢)，華中農業大學動物醫學院，武漢 430070)

地克珠利(Diclazuril，DIC)是三嗪類新型廣譜抗球蟲藥，其化學名為氯嗪苯乙腈，在低劑量時能有效控制雞盲腸球蟲，破壞球蟲卵囊，在家禽養殖中廣泛使用[1]。DIC對雞常見球蟲類型均有良好的效果，如柔嫩、堆型、毒害、布氏、巨型、和緩艾美耳球蟲，抗球蟲作用因球蟲種屬不同略有差異[2]。研究結果表明，其抗球蟲效果優于莫能菌素、氨丙啉、尼卡巴嗪等抗球蟲藥，具有高效低毒的特點，是目前混飼濃度最低的一種抗球蟲藥[3]。抗球蟲藥物的大量使用可能導致藥物原形或代謝產物蓄積于可食性動物產品(組織、牛奶、雞蛋等)中，從而進入到食物鏈中威脅人類健康。雞蛋是生活中常見的高營養食物之一，我國每年生產并消費世界40%左右的雞蛋，人均雞蛋消費量約為世界水平的2倍[4]。在蛋雞產蛋期使用禁用藥物，未嚴格遵守休藥期和墊料或飲水中的藥物暴露，均會導致雞蛋中藥物殘留，造成食品安全的潛在風險[5]。已有文獻報道DIC在雞蛋中存在殘留的發生[6]。DIC臨床使用劑量用少，連續用藥后在雞體內消除慢，僅含有5%的殘留物也需要長達15 d的時間才能成為無殘留的雞蛋[7]。農業農村部在《食品安全國家 食品中獸藥最大殘留限量》(GB31650-2019)中規定，家禽產蛋期禁用DIC[8]。然而，臨床實際應用過程中因未及時觀察給藥時間，墊料、飼料及水源的交叉感染等原因都可能會導致雞蛋中的DIC殘留發生。由于DIC是批準用于蛋雞養殖的藥物，只是禁止用于產蛋期。其食品安全風險遠低于禁用藥，如果以零檢出判定蛋產品的安全性過于嚴苛，對蛋雞養殖會造成困擾。本試驗擬建立超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)檢測雞蛋中地克珠利含量的方法，通過研究地克珠利在雞蛋中的殘留消除情況，結合國際食品安全性評價規范，初步確定DIC在雞蛋中的最大殘留限量，并提出棄蛋期，為地克珠利在蛋雞生產上的安全應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 地克珠利標準品(生產批號101831-37-2，含量99.8%)，購自中國獸醫藥品監察所；地克珠利溶液(批準文號：獸藥字190752045，含量0.5%)，購自廣東萬士達動物藥業有限公司；色譜純甲醇和乙腈購自西班牙Scharlau公司；分析純甲醇和乙腈購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器 Waters Acquity超高效液相色譜儀，配備Waters Quattro Premier XE質譜分析儀。Avanti J-25型高速冷凍離心機，購自日本日立公司。JQ-3200型超聲波清洗器，購自昆山市超聲儀器有限公司。MILLIPORE IQ 7000型超純水儀，購自貝萊美生物科技有限公司。XW-80A微型渦旋混合儀，購自上海滬西分析儀器廠有限公司。微量移液器，200 μL/ 1 mL/ 5 mL，購自Eppendorf Research plus。PL203分析天平(Max=210 g，d=0.001 g)，購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。SQP電子天平(Min=10 mg，Max=220 g，d=0.1 mg)，購自賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。

1.3 試驗動物及分組 選取體重約1.7 kg的30只健康高產白羽蛋雞，隨機分為空白組(5只)和給藥組(25只)，給予無抗菌飼料以及隨意飲水，環境溫度保持在25 ℃左右。每天監測母雞生理狀況，適應環境1周。

1.4 給藥與采樣 0.5%地克珠利溶液用飲用水稀釋成1 mg/L，給藥組經飲水給藥連續給藥12 d，空白對照組給予等量飲用水。自給藥當天，每天收集雞蛋直至停藥后25 d。給藥組每天至少收集20枚雞蛋，空白對照組收集雞蛋樣本作為空白對照，所有樣品均質后保存在-20 ℃冰箱中直至分析。

1.5 樣品處理 分別稱取均質蛋清、蛋黃和全蛋雞蛋樣品1 g (精確到0.01 g)于10 mL 離心管中，精密加入乙腈溶液2.5 mL，渦旋3 min，超聲10 min，4500 r/min離心10 min，再用同樣的方法重新提取一次，將兩次提取的上清液合并后移至50 mL離心管中，加入5 mL正己烷去脂，取上清液備用。

凈化：OASIS PRiME HLB固相萃取柱(6cc,200 mg)無需活化，1 mL 80%乙腈水預洗后，取上述提取上清液2.5 mL，將其過柱，取1 mL濾液經 0.22 μm微孔濾膜過濾后，用UPLC-MS/MS測定。

1.6 樣品分析

1.6.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 Column(2.1×50 mm, 1.7 μm)；流動相：A相為乙腈；B相為超純水溶液；流速：0.2 mL/min；進樣量：5 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表Tab 1 Gradient elution schedule

1.6.2 質譜條件 采用ESI離子源，負離子(ESI-)模式掃描，多離子反應監測(MRM)模式測定，質譜參數如表2所示。

表2 地克珠利物質譜檢測的特征離子參數Tab 2 Characteristic ion parameters of diclazuril mass spectrometry

1.6.3 基質標準工作曲線 分別取空白全蛋樣品、蛋清及蛋黃樣品1 g加入適量地克珠利標準溶液，使樣品中藥物終濃度為1、10、100、200、500 μg/kg，經樣品前處理之后，進行UPLC-MS/MS測定，以特征離子質量色譜峰面積為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制基質標準工作曲線。

1.6.4 精密度和準確度 分別取空白全蛋樣品、蛋清及蛋黃樣品1 g加入適量地克珠利標準溶液，使樣品中藥物終濃度為2.5、10、50 μg/kg，經樣品前處理之后，進行UPLC-MS/MS測定，計算回收率。基質添加樣品分為5批，連續3 d測定計算日內和日間變異系數。回收率計算公式(1)如下：

(1)

式中，X：試樣中待測物回收率；A：試樣峰面積；As:標準工作液峰面積；W：試樣體積(mL)；V：待測提取液的總體積(mL)。

1.6.5 靈敏度 本試驗方法的靈敏度包括檢測限(Limit of detection，LOD)和定量限(Limit of quantification，LOQ)。LOD是指樣品中能夠檢測到的被測物的最低含量，LOQ是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結果應具有一定的準確度與精密度。將低濃度的標準工作液進行稀釋，添加到各個空白組織中，經樣品前處理之后，過0.22 μm濾膜進行上機檢測。以信噪比(S/N≥3)時的待測物濃度定義為LOD；以信噪比(S/N≥10)時待測物的濃度定義為LOQ。

1.6.6 穩定性 分別取空白全蛋樣品、蛋清及蛋黃樣品1 g加入適量地克珠利標準溶液，使樣品中藥物終濃度為2.5、10、50 μg/kg，每個濃度設置5個重復，經樣品前處理之后分別于4 ℃條件下放置24 h，-20 ℃冰箱冷凍放置24 h，-20 ℃反復凍融3次，進行UPLC-MS/MS測定，計算峰面積和RSD值。

1.7 數據處理

1.7.1 消除動力學參數計算 將蛋清、蛋黃和全蛋中測得的地克珠利的色譜峰面積代入基質標準工作曲線，得到地克珠利在雞蛋中的殘留量。將三種雞蛋樣品中各時間點的地克珠利含量進行對數轉換，將對數轉換后藥物濃度與時間做回歸分析，進行殘留曲線擬合，根據回歸方程lnC=lnC0-kt(C:任一時間點藥物濃度，C0：初始濃度，k：消除速率常數)，計算地克珠利在三種雞蛋樣品中的消除方程C=C0ekt和消除半衰期t1/2(t1/2=0.693/k)。

1.7.2 最大殘留限量和棄蛋期 根據地克珠利預期用途和在適用的食用組織的食物消耗值中進行ADI值的分配，計算地克珠利在雞蛋中的ADI值和初步理論限量值。根據雞蛋中地克珠利的初步理論限量值，代入公式(2)中計算雞蛋中安全濃度(Safe Concentration, SC)。

將安全濃度的值代入公式(3)計算最大殘留限量。

MRLe=SCe×Rm×Re

(3)

式中，MRLe指蛋中最高殘留限量(μg/kg)；SCe指蛋中安全濃度(μg/kg)；Rm指殘留標示物與總殘留的比例(%)；Re指定量分析方法回收率(%)。

地克珠利在蛋黃、蛋清及全蛋樣品的殘留消耗速率不完全相同，參照雞蛋中地克珠利的臨時MRL，采用WT1.4軟件，以95%的可信限為標準，DIC在對三種雞蛋樣品中殘留量進行線性回歸分析。樣品中DIC濃度高于MRL的時間段為棄蛋期。

2 結果與分析

2.1 最低檢測限與最低定量限 依據3倍信噪比確定檢測限，地克珠利在雞蛋全蛋樣品，蛋清樣品及蛋黃樣品的檢測限均為0.5 μg/kg；依據10倍信噪比確定檢測限，地克珠利在雞蛋全蛋樣品，蛋清樣品及蛋黃樣品的定量限均為2.5 μg/kg。結果表明，該方法靈敏度高，滿足地克珠利在蛋清、蛋黃和全蛋中殘留檢測的需要。

2.2 特異性和專一性 空白的雞蛋全蛋樣品、蛋清樣品和蛋黃樣品添加2.5 μg/kg(定量限濃度)的地克珠利標準品溶液，按照已建立好的樣品前處理方法處理后上樣檢測，如圖1所示：DIC在2.3 min處出峰，且附近無雜峰出現，顯示出該方法的特異性良好，符合定量方法學考核要求。地克珠利的標準曲線及在雞蛋全蛋樣品基質、蛋黃基質、蛋清基質線性回歸方程及相關系數見表3，相關系數r>0.998，線性良好。

(a:空白蛋清；b:空白蛋黃；c:空白全蛋；d:蛋清加標；e:蛋黃加標；f:全蛋加標)(a: Blank egg white; b: Blank yolk; C: Blank whole egg; D: Egg white added DIC; E: Egg yolk added DIC; F: Egg added DIC)圖1 地克珠利在蛋清、蛋黃和全蛋中的色譜圖Fig 1 Chromatogram of diclazuril in egg white, egg yolk and egg

表3 地克珠利標準曲線方程及相關系數Tab 3 The standard curve equation and correlation coefficient of diclazuril

2.3 準確度和精密度 方法的準確度用回收率表示，精密度用日內間變異系數表示，結果如表4所示：本方法在2.5～50 μg/kg添加濃度水平上的雞蛋樣品的平均回收率為75.90%～90.38%，地克珠利在全蛋樣品、蛋清樣品及蛋黃樣品的日內變異系數分別為：3.23%～5.88%、4.12%～8.26%、7.20%～8.14%，日間變異系數分別為：4.00%～7.11%、4.62%～8.21%、7.01%～7.74%。本試驗所建立的地克珠利在雞蛋樣品中的殘留檢測方法符合方法學考核要求，可用于地克珠利在雞蛋(全蛋、蛋清、蛋黃)中的殘留消除研究。

表4 地克珠利在全蛋、蛋清和蛋黃中的回收率和精密度Tab 4 Recovery and precision of diclazuril in whole egg, egg white and yolk

2.4 穩定性 地克珠利標準溶液和在空白的全蛋樣品、蛋清樣品、蛋黃樣品添加2.5，10，50 μg/kg三個濃度水平的樣品的穩定性如表5所示，在4 ℃條件下放置24 h，-20 ℃冰箱冷凍放置24 h，-20 ℃反復凍融3次的條件下，經檢測地克珠利標準溶液樣品間的RSD值小于6.91%，蛋清加標樣品間的RSD值小于7.36%，蛋黃加標樣品間的RSD值小于6.36%，全蛋加標樣品間的RSD值小于8.11%。結果表明，地克珠利標準溶液、蛋清加標樣品、蛋黃加標樣品和全蛋加標樣品的穩定性良好。

表5 地克珠利標準溶液和樣品穩定性Tab 5 Diclazuril standard solutions and stability of samples

2.5 地克珠利在雞蛋中的殘留消除特征 蛋雞連續12 d給藥后，在12 d時全蛋樣品的最高濃度，濃度為229.54±1.09 μg/kg；停藥后3 d時，觀察到DIC濃度下降為164.85±3.61 μg/kg。停藥14 d時，DIC殘留濃度降低至一個較低的水平(16.11±0.57 μg/kg)，停藥21 d后檢測不到DIC存在，全蛋中消除半衰期為T1/2為1.78 d；蛋清中DIC的分布相對于蛋黃較低，12 d時殘留濃度最高，為88.12±2.79 μg/kg，停藥10 d時降至較低的殘留水平(12.53±0.38 μg/kg)，消除半衰期為T1/2為6.93 d，第14天時蛋清樣品中檢測不到DIC存在；監測到蛋黃的最高殘留濃度為311.02±4.46 μg/kg(給藥后第12天)，殘留消除過程較為緩慢，消除半衰期為T1/2為2.57 d，第14天時降至較低的濃度(26.04±2.45 μg/kg)，第21天后檢測不到DIC(表6)。

表6 雞蛋樣品中地克珠利殘留量(n=10)(μg/kg)Tab 6 Diclazuril residue in egg samples(n=10)(μg/kg)

DIC在蛋清、蛋黃和全蛋樣品中的消除參數及消除曲線如表7和圖2所示。

表7 雞蛋中地克珠利的消除參數Tab 7 Elimination parameters of diclazuril in eggs

圖2 地克珠利在雞蛋中的消除曲線Fig 2 The elimination curve of diclazuril in eggs

2.6 最大殘留限量和棄蛋期推算

2.6.1 ADI值的確定和分配 GB 31650-2019中規定地克珠利的ADI值為0.03 mg/kg.bw。ADI的分配根據藥物預期用途和每個組織的食物消耗值在適用的食用組織中進行劃分。

WHO推薦的食物消費系如下：一個60 kg體重的人，一天動物性食物消費量：哺乳動物或禽肉500 g(其中：肌肉300 g，肝臟100 g，腎臟50 g，脂肪50 g)；或者魚肉300 g。另加奶 1500 g，雞蛋100 g，蜂蜜50 g。將ADI值(100%)按比例分配到各種食品動物的可食性組織中。

根據藥物批準使用的動物不同，應將ADI值在不同組織中分配：如果藥物批準用于肉牛、豬、肉禽，則只考慮分配至肌肉+脂肪+肝+腎中；如果藥物還批準用于奶牛和/或奶羊，則還要考慮分配到奶中，即肌肉+脂肪+肝+腎+奶；如果藥物還批準用于蛋禽，則還要分配到蛋中，即肌肉+脂肪+肝+腎+蛋；如果藥物還批準用于蜜蜂，則還要分配到蜂蜜中，即肌肉+脂肪+肝+腎+蜂蜜；如果藥物同時批準涉及以上所有的動物，則應將全部ADI值分配到所涉及的上述組織和產品中，即肌肉+脂肪+肝+腎+奶+蛋+蜂蜜。

每種可食性組織中ADI的分配比例原則上等于該組織的推薦消耗量與批準動物的推薦可食性組織總量的比值，也可根據具體情況酌情分配。地克珠利ADI值為30 μg/kg體重，并且批準使用于畜禽，因此，ADI的分配值考慮畜禽肌肉300 g、肝臟100 g、腎臟50 g、脂肪50 g和雞蛋100 g。據此，分配給雞蛋的ADI值應為根據藥物的ADI值與食物分配系數，計算出地克珠利在雞蛋中的初步理論限量值：

2.6.2 安全濃度計算 安全濃度(Safe Concentration, SC)是指食品動物用藥后，動物性產品任何可食用部分允許人終生每日攝入且不超過ADI的藥物總殘留量。每種可食性組織中安全濃度的計算均基于一個60 kg的成年人每日攝入WHO推薦的食物消費量，同時考慮ADI的分配比例，雞蛋中安全濃度為：

2.6.3 臨時MRL標準建議 鑒于我國規定蛋雞產蛋期禁止使用地克珠利，現有文獻未能提供蛋中殘留標示物占總殘留的比例，按FDA推薦的主要代謝物判定標準10%進行保守估計，制訂地克珠利在雞蛋中的臨時MRL標準。

MRLe=SCe×Rm×Re=3000×10%×80%=
240(μg/kg)。

其中，MRLe指蛋中最高殘留限量(μg/kg)；SCe指蛋中安全濃度(μg/kg)；Rm指殘留標示物與總殘留的比例(%)；Re指定量分析方法回收率(%)。為便于實際應用，將MRL進行取整。因此，建議雞蛋中地克珠利的臨時MRL為240 μg/kg。

2.6.4 棄蛋期 參照雞蛋中地克珠利的臨時MRL為240 μg/kg，蛋清和全蛋樣品中地克珠利的濃度低于240 μg/kg，因此，以蛋黃樣品進行棄蛋期分析。采用WT1.4軟件，以95%的可信限為標準，MRL設為240 μg/kg，曲線擬合結果如圖3所示。結果表明，自給藥第5.11天開始，截止到停藥第7.38天，蛋黃中地克珠利的含量均超過MRL，因此，棄蛋期從給藥第5天至停藥第8天，共16 d。

(a:給藥期；b:停藥期)(a: Administration period;b: Withdrawal period)圖3 地克珠利在雞蛋的棄蛋期擬合圖Fig 3 Diclazuril in the off-drug period of eggs

3 討 論

3.1 色譜條件的優化 目前，地克珠利的色譜條件在多篇文獻中均有報道，侯軒等[9]采用0.2%甲酸水：乙腈(70∶30，V/V)的流動相進行梯度洗脫，樣品運行時間為12 min。陳彤等[10]采用0.1%甲酸水：甲醇(90∶10，V/V)的流動相進行梯度洗脫，樣品運行時間為6 min。為了達到快速檢測雞蛋中地克珠利含量的目的，本研究優化了樣品運行時間， 在4 min內完成雞蛋中地克珠利含量的檢測。同時，本研究中比較了不同流動相相對分離度、峰形、靈敏度等影響。結果發現：水相的酸堿度對地克珠利的分離影響不大，對質譜響應值也無明顯影響，加入甲酸并沒有提高響應值。有機相用乙腈比用甲醇時地克珠利峰形更好。因此，本研究采用乙腈-水作為流動相體系。

3.2 樣品提取與凈化 雞蛋是磷脂含量最高的食物之一，此外還含有大量的脂肪，極大干擾目標化合物的分析。目前，國內外關于地克珠利的提取與凈化方法有許多報道[6,9,11-14]，提取試劑一般為乙酸乙酯、乙腈、甲醇、乙腈和乙酸乙酯(5∶2)混合溶液。本試驗比較了不同提取劑對樣品回收率的影響，結果表明甲醇提取效果較差，回收率較低，為45%～50%，使用乙腈和乙酸乙酯提取，回收率為70%～95%，但乙酸乙酯提取雜質較多，影響后續凈化步驟。而乙腈能夠有效沉淀蛋白，防止樣品基質中雜質堵塞固相萃取柱，因此選擇乙腈作為樣品提取液。同時，本研究比較了OASIS HLB固相萃取柱和OASIS PRiME HLB固相萃取柱的凈化效果，結果表明，OASIS HLB小柱的凈化效果較弱，回收率為55%～60%，并有雜峰干擾，無法有效地去除蛋黃樣品中的磷脂和脂肪，凈化后的液體渾濁，對儀器有損害作用。OASIS PRiME HLB小柱具有步驟簡單、洗脫液清澈、凈化快速的優勢，能有效去除雞蛋樣品中的磷脂和脂肪等雜質，回收率在80%左右。因此，OASIS PRiME HLB(6cc,200 mg)固相萃取柱凈化效果更好。

3.3 地克珠利在雞蛋中的殘留消除規律 參照《獸藥殘留試驗指導原則(征求意見稿)》及臨床推薦給藥劑量制定地克珠利給藥12 d的試驗方案。結果表明，給藥期間蛋清、蛋黃和全蛋中地克珠利殘留量與給藥時間成正比，最高殘留量均出現在給藥第12天，蛋黃中地克珠利殘留濃度最高，在蛋清中殘留濃度最低。這可能與藥物在雞蛋中殘留濃度與蛋黃和蛋清的形成時間密切相關，蛋白的形成時間為1～2 d，蛋黃在卵巢中形成時間為12 d[15]。停藥后蛋清、蛋黃和全蛋中地克珠利殘留前期消除較快、后期消除緩慢，從消除半衰期來看，地克珠利在蛋清中滯留時間比在蛋黃中長，消除更慢，這可能與地克珠利與蛋白質的結合的穩定性密切相關，穩定性越好，在蛋清中的殘留越長[16]。

4 結 論

目前，國內外關于地克珠利在雞蛋中的殘留消除研究很少，隨著抗球蟲藥物的廣泛使用，地克珠利在雞蛋中的殘留情況不容忽視。本研究針對雞蛋中地克珠利殘留建立了一種簡單、高效、靈敏的UPLC-MS/MS檢測方法，并首次研究和探討了地克珠利在蛋清、蛋黃和全蛋中的殘留消除規律，地克珠利在蛋黃中消除最快，在蛋清中消除最慢。根據地克珠利在雞蛋中的殘留情況，建議雞蛋中地克珠利的最大殘留限量為240 μg/kg，棄蛋期從給藥第5天至停藥第8天，共16 d，為臨床應用提供科學依據。