五倍子提取物有效成分含量分析與體外抑菌活性比較

李云超，魏思敏，田啟明，趙 昕，李金貴*

(1.揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州 225009；2.江蘇省高校動物重要疫病與人畜共患病防控協同中心，江蘇揚州 225009)

植物是許多現代藥物發現和開發的重要來源。約25%的現代藥物來源于植物，但僅有5～15%的植物被研究過其藥用價值[1]。目前，天然植物、中草藥或藥用植物、功能性食品得到了廣泛的研究，在糖尿病、免疫調節、抗炎和抗菌活性等方面獲得了一些很有價值的治療藥物[2-4]。

在藥用植物中，五倍子(Gallachinensis，GC)作為一種傳統中藥材已有上千年的使用歷史，對腹瀉、痢疾、敗血癥、炎癥、齲病等多種疾病有防治作用，還有抗癌、抗生育、抗氧化等功效[5]。GC的水提取物(aqueous extract of GC, GCE)含有大量的單體和聚合多酚，如沒食子酸單寧(Gallotannin, GT)、沒食子酸(gallic acid, GA)和沒食子酸甲酯(Methyl gallate, MG)以及一些碳水化合物、蛋白質和其他成分[6]。目前已經從GCE中鑒定了幾種化合物的分子結構(圖1)[7,8]。GT是一種水解單寧，被認為是GC的主要成分，其含量往往占五倍子干重的50%以上。GA又稱五倍子酸，化學名為3,4,5-三羥基苯甲酸，是結構最簡單的天然多酚類化合物；MG為GA的衍生物。三者均已被證明具有抗氧化、抗炎、抗微生物等生物學活性[9,10]。結構-活性關系研究表明，GT抗氧化活性隨著沒食子酰基數量的增加而增強，其中含6～7個沒食子酰基的GT對傷寒沙門菌和蠟樣芽孢桿菌的抗菌活性最好[11]，且含量相對較高而被認為是GCE抗菌活性的關鍵物質。然而，少有研究對GT、GA和MG在GCE中的含量和抗菌作用進行比較。為此，本研究采用大孔樹脂對GCE中GT進行分離，同時收集脫GT后的剩余物(GTrE)，然后采用高效液相色譜法(HPLC)測定兩者中GA和MG的含量，并比較各組分對臨床分離耐藥菌的抑制作用。

a. 五倍子單寧；b. 五倍子酸或沒食子酸；c. 沒食子酸甲酯圖1 五倍子中已知分子結構的幾種化合物

2 材料和方法

2.1 菌株 大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)臨床分離株，由揚州大學動物醫院畜禽門診部王彥紅博士贈予。標準菌株ATCC25922和ATCC29213為本實驗室保存株。

2.2 試驗藥品 五倍子(Gallachinensis, GC)，購自中國同仁堂藥店(中國揚州)。試驗用抗生素氨芐西林(AMP)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢喹肟(CEF)、多西環素(DOX)、卡那霉素(KAN)、阿米卡星(AMK)、鏈霉素(STR)，環丙沙星(CIP)、恩諾沙星(ENR)、新霉素(NEO)和黏桿菌素(COL)等購自上海吉智生化科技有限公司(中國上海)，分別以無菌蒸餾水或培養基中制備成新鮮儲備溶液。LB培養基購自Thermo ScientificTM。GT、GA和MG對照品購自北京索拉比奧科技有限公司。HPLC級和分析級溶劑購自上海阿拉丁生化科技有限公司。

2.3 五倍子提取物的制備 將GC粉碎成100目的粉末，稱取5.0 g加入50 mL去離子水中煎煮2 h； 將水煎液通過Whatman 1號濾紙以去除顆粒物，濾液經旋轉蒸發器減壓濃縮，溶于無菌水中并調整濃度為0.5 g/mL，4 ℃保存備用[12]。

2.4 大孔樹脂吸附法提取沒食子酸單寧(GT)和脫單寧剩余物 將2.3節方法獲取的水提物GCE裝載在大孔樹脂(XDA-6)柱上。XDA-6樹脂分離GT的最佳工藝參數如下：1)吸附條件：吸附溫度28 ℃、柱徑高比1∶8，進料量2.0 bv，流速1.0 bv/h；2)解吸：洗脫溶劑為水溶液/乙醇(15∶85 v/v)，洗脫液體積2.0 bv，流速1.0 bv/h[13]。將分離出來的GT和脫GT剩余溶液結晶物(GTrE)分別收集、干燥、稱重后發現5 g GC粉末提取物中分離獲得的GT和GTrE分別為2.915 g和1.14 g。然后稱取適量并配制成相應濃度的溶液與GA和MG等一起用于抗菌活性評價。

2.5 高效液相色譜法檢測GCE、GT和GTrE中GA和MG含量 所有標準品和試驗樣品均在日本島津HPLC系統上檢測，色譜柱為Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，以甲醇(A)和0.5 % H3PO4水溶液(B)為流動相。HPLC程序見表1所示；上樣體積為20 μL、柱溫為35 ℃。對于GA，設定流速為1 mL/min，流動相A/B比例為15/85；對于MG，流速為0.5 mL/min，流動相A/B比例為40/60，兩者的檢測波長均為275 nm。

2.6 藥敏試驗和藥物聯合作用的棋盤試驗 使用微量肉湯稀釋法測定受試抗生素、GCE及其化學組分對上述兩種臨床分離菌株的MIC[14]。根據CLSI判定標準解釋MIC結果，以標準菌株ATCC25922和ATCC29213作為試驗質控菌。

根據所測得的GT和GTrE對每種菌株的MIC值，采用棋盤稀釋法測定GT和GTrE的聯合的分級抑菌濃度(fractional inhibitory concentration, FIC)：即將GT和GTrE分別用鈣離子調節的無菌MH 肉湯倍比稀釋為2 MIC、1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC和1/32 MIC，各取50 μL分別排列在96孔板的行與列上，然后每孔加入100 μL處于對數生長期的測試菌液，使菌液濃度為5×105CFU/mL，同時以無菌MH 肉湯作為陰性對照，不含藥物的稀釋菌液作為陽性對照，然后在37 ℃下培養16～20 h讀取結果，以無細菌生長的最低藥物濃度為MIC。GT和GTrE之間的相互作用通過計算分數抑制濃度指數(FICI)來確定。結果判定標準如下：FICI≤ 0.5為協同作用；0.54.0，為拮抗作用[15]。同時設定陽性和陰性對照孔，每個數據至少重復3次。

2.7 統計分析 試驗數據以平均值±標準誤(Mean±SE)表示，并采用PRISM(6.0版)軟件進行差異顯著分析，P<0.05時表示差異顯著。

3 結果與分析

3.1 臨床分離菌的耐藥性測試結果 11種受試抗生素對E.coli和S.aureus臨床分離株的MIC測試結果見表1。根據CLSI判定標準，這些菌株對11種抗生素表現出不同的耐藥性。在受試菌株中，4株臨床分離E.coli均對6種以上的抗生素表現出明顯的耐藥性；3株S.aureus則對受試的四種抗生素(STR、KAN、CIP、ENR)表現出耐藥性。這說明分離菌株均為多藥耐藥菌株。

表1 不同抗生素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌臨床分離株的MIC測定Tab 1 MICs of different antibiotics for clinical E. coli and S. aureus isolates.

3.2 GCE及其組分對E.coli和S.aureus的抑制作用比較 試驗比較了大孔樹脂分離的GCE、GTrE和商品化GT、GA和MG對兩種臨床分離菌的抑菌作用，MIC測試結果見表3。GCE對E.coli和S.aureus菌株的MIC分別為8和0.25 mg/mL，即E.coli不同菌株的MIC是對S.aureusMIC的32倍，說明GCE對S.aureus的抑制作用較強，有一定的選擇性。商品化的GT與我們大孔樹脂分離的GT對兩種耐藥菌的抑制作用類似，且與GCE類似，都對S.aureus有較強的抑制作用。純品GA對E.coli的MIC與GCE接近，但對S.aureus的MIC則是GCE的20倍或40倍；MG也表現出類似的趨勢，故GA和MG對S.aureus的抑制作用明顯低于GCE、GT。GTrE對兩種耐藥菌的抑制作用略強于GCE。

以上數據均顯示，GCE、GTrE、GT對S.aureus的抑制作用更強，而純品GA和MG對E.coli和S.aureus的MIC相似，GA和MG對S.aureus的抑制作用均明顯弱于GCE、GTrE、GT(表2)。

表2 GCE及其組分對大腸桿菌和金葡菌臨床分離株的MICsTab 2 MICs of GCE and its components for clinical E. coli and S. aureus isolates.

3.3 大孔樹脂分離GT與GTrE對兩種臨床分離菌的聯合作用 上述試驗已證明GT和GTrE對兩種受試菌均具有明顯的抑菌作用，但兩者的聯合效應還不清楚。本試驗經過FICI測定發現，除了對E.coli中的兩個分離株(E.coli0301E1-H2和E.coli0220E1-1)表現為無相互作用外，兩者聯合應用對其余菌株的抑制均顯示出相加作用(表3)。

表3 分離GT和GTrE對臨床分離株的分級抑菌濃度指數Tab 3 FICI of separated GT in combination with GTrE for clinical E. coli and S. aureus isolates.

3.4 GCE中GA和MG的HPLC定量測定 以濃度為X軸，峰面積為Y軸，繪制了GA和MG的標準曲線(圖2)，得到回歸方程。兩者標準曲線的相關系數均大于0.999，說明線性關系良好。

圖2 GA(a)和MG(b)的標準曲線及回歸方程Fig 2 Standard curve of GA (a) and MG (b), and their regression equation

GA和MG的線性范圍分別為2～50 μg/mL和0.5～10 μg/mL(表4)。根據圖2的回歸方程和樣品的峰面積計算不同提取物干燥樣品中GA和MG的含量百分比(表4)。結合前面表2的結果可以發現GCE對不同分離株E.coli的MICs為8 mg/mL，然而，GA在GCE中的含量僅為3.1665%，這意味著GCE中GA的實際濃度為0.25 mg/mL；但純品GA對E.coli的MICs為5～10 mg/mL，這是GCE中GA實際濃度的20倍以上。與之相似的是，純品MG對受試菌株的MIC雖然略低于GA，但其在GCE中的含量更低，僅為0.0899%，實際濃度則為0.0072 mg/mL，純品MG對E.coli的MIC為2.5 mg/mL，是GCE中MG實際濃度的340多倍。結合表2中的數據，純品GA和MG對S.aureus的MIC均明顯高于GCE、GT和GTrE。這提示GA和MG應該不是五倍子提取物抗菌活性的主要成分。

表4 GCE、分離GT和GTrE中GA和MG含量的測定Tab 4 Contents of GA and MG in GCE and its different extract.

4 討論與結論

目前，多藥耐藥菌的傳播速度比新藥創制的速度快，引起了較為嚴重的公共衛生危機，從天然植物或中藥中篩選具有抗菌活性的提取物及其組合來替代現有抗菌藥已經成為一種現實且有益的探索。近年來的研究表明，五倍子(GC)或其提取物具有很強的抗病毒、抗癌、保肝、止瀉和抗氧化活性[5]，在抗菌方面證明對大腸桿菌和變形鏈球菌生物被膜的形成具有顯著的抑制作用[16]。

盡管已有很多GC提取物抗菌活性的報道，但其活性成分的關聯性還沒有完全確定。對GC中有效成分結構與抗菌效應關系的初步研究表明，GC粗提物及其它成分具有顯著的防齲效果，由于粗提物含有多種化合物，其生物活性是多種化合物協同作用和/或拮抗作用的結果，故目前仍不清楚其確切的抗菌機制[8]。研究發現GCE和GTrE對兩種臨床分離耐藥菌均具有明顯的抗菌活性，兩者對臨床分離菌株(E.coli和S.aureus)的MIC相似，但它們對E.coli的MIC是S.aureus的32倍，說明GC提取物對S.aureus抑制作用的選擇性更強，因而有望用于防治S.aureus引起的感染。本研究使用大孔樹脂獲得的GT，干燥后稱重發現可達到GC干重的58.3%，與商品GT對比研究發現，兩者對E.coli和S.aureus具有相似的抑菌作用；脫單寧后剩余部分的干燥品，即GTrE，含量達到GC干重的22.8%，且其對兩種受試菌的抑制作用略好于GT。故推測GT和GTrE很可能是GC發揮抗菌作用的有效成分。

此外，研究還測定了GCE中GA和MG的含量，并檢測了其抑菌活性，發現它們對E.coli的MIC與GCE或GT接近，但對S.aureus的作用明顯弱于GCE，分析兩者在GCE、GTrE中的含量發現，兩者在GCE和GTrE中含量有類似的規律，GA在GCE中的含量為3.16%左右，與報道的2～4%范圍一致[17]；而MG僅為0.0899%，比報道的含量略高[18]，故總體上看，兩者含量都比較低，在GCE中的濃度且遠遠低于其純品的MICs(表4)。故可以推測GA和MG應該不是GC提取物中的主要抑菌活性成分。

綜上所述，GCE與其中含量較高的GT對臨床分離耐藥大腸桿菌和金葡菌均有顯著的抑制作用，但對金葡菌的抑制作用更強，有望成為控制該菌感染的候選藥物；GA和MG雖具有抗菌活性，但在GCE中的含量很低，故可能不是主要的抗菌成分。除GT外，GC中還有未經鑒定的化合物或其組合具有類似強度的抑菌作用，還需要進一步研究。