頂空毛細管GC法測定馬波沙星原料藥中6種溶劑的殘留量

董玲玲，汪 霞，楊 星，馬秋冉，于曉輝，趙富華

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

馬波沙星(Mabofloxacin) 又名麻保沙星，化學名為9-氟-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧代-2,3-二氫-7H-吡啶-[3,2,1-ij][4,1,2]-苯并噁二嗪-6-羧酸，通過抑制細菌復制中所需的 DNA 拓撲異構酶II和IV而表現殺菌作用[1]，是一種動物專用的第三代喹諾酮類抗菌藥物，抗菌譜廣，對絕大多數革蘭氏陽性菌有較強的抗菌活性[1-2]，且具有很高的生物利用度[3]，統計國內現有企業馬波沙星原料的合成工藝，使用了包括甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯與甲苯在內的6種溶劑[4-6]，因此，根據《中國獸藥典》2015年版[7]及VICH[8]的相關規定，采用頂空毛細管氣相色譜法同時測定上述6種溶劑的殘留量。

1 儀器與試藥

Agilent 7890A氣相色譜儀，配Agilent 7697A頂空進樣器及FID檢測器，ChemStation色譜工作站;METTLER TOLEDO XS 205電子天平。甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯與甲苯均為分析純。N,N-二甲基甲酰胺為色譜純。馬波沙星原料來自兩個企業，企業1批號:171101、171201、171202；企業2批號：160919、161011、170306。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:DB-624毛細管柱(30 m×0.53 mm, 3.0 μm)； 載氣:高純氮; 初始溫度為40 ℃，維持10 min后，以每分鐘20 ℃的速率升溫至80 ℃，維持2 min，再以每分鐘30 ℃的速率升溫至200 ℃，維持5 min。以氮氣為載氣，線速為每秒24.1 cm，分流比為5∶1；進樣口溫度為180 ℃；檢測器為火焰離子化檢測器(FID)，檢測器溫度為250 ℃；頂空瓶平衡溫度為105 ℃，平衡時間為20 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液制備 取本品約0.1 g，精密稱定，置頂空瓶中，精密加N,N-二甲基甲酰胺1 mL，密封，作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液配制方法 分別精密稱取甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯與甲苯適量，加二甲基甲酰胺定量稀釋制成每1 mL中分別含甲醇0.3 mg、乙醇0.5 mg、乙腈0.041 mg、二氯甲烷0.06 mg、苯0.002 mg和甲苯0.089 mg 的混合溶液，精密量取1 mL，置頂空瓶中，密封，作為對照品溶液。

2.3 專屬性 溶劑空白：精密量取1 mL N,N-二甲基甲酰胺置頂空瓶中，密封，即得。取溶劑空白及2.2項下的對照品溶液和供試品溶液按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖(圖1～圖4)。結果表明，空白溶劑無干擾峰出現; 對照品溶液色譜圖中，各殘留溶劑分離度良好；兩個企業供試品色譜圖中，殘留溶劑出峰處無干擾。

圖1 溶劑空白色譜圖(DMF)Fig 1 Chromatogram of solvent(DMF)

圖2 殘留溶劑對照品溶液色譜圖出峰順序依次為甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯、甲苯、DMFFig 2 Chromatogram of six kinds of residual solventsThe peak outflows by methanol, ethanol, acetonitrile, dichromethane, benzene and toluene

圖3 供試品溶液殘留溶劑色譜圖(企業1)Fig 3 Chromatogram of Marbofloxacin draw material (sample1)

圖4 供試品溶液殘留溶劑色譜圖(企業2)Fig 4 Chromatogram of Marbofloxacin draw material (sample2)

2.4 檢測限和定量限 取對照品溶液加N,N-二甲基甲酰胺系列稀釋，按2.1項下色譜條件進樣測定，以信噪比約為3時的濃度，作為檢測限；以信噪比約為10時的濃度，作為定量限，結果見表1。

2.5線性和范圍 分別精密稱取6種殘留溶劑適量，用N,N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋使成每1 mL中含甲醇30.0 mg、乙醇50.0 mg、乙腈4.1 mg、二氯甲烷6.0 mg、苯0.02 mg 和甲苯8.9 mg 的對照貯備液，用N,N-二甲基甲酰胺逐步稀釋使成梯度濃度。分別精密量取上述稀釋溶液各1 mL，置頂空瓶中，密封，進樣。以濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，分別進行線性回歸，結果6種溶劑的濃度與峰面積均呈良好的線性關系(表1)。

表1 馬波沙星殘留溶劑的標準曲線、檢測限和定量限結果表Tab 1 Results of range, linearity, limit of detection and limit of quantification.

2.6 精密度 取2.5項下的對照貯備液0.1 mL至10 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，平行制備6份，按2.1項下色譜條件進樣測定，甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯、甲苯6次進樣峰面積的RSD結果分別為2.1%，3.0%，3.8%，2.8%，3.3%和4.9%，精密度良好。

2.7 重復性 取馬波沙星原料(企業1，批號171202) 制備供試品溶液6份，按2.1項下色譜條件分別進樣，檢出甲醇含量的均值為0. 01%，RSD為0%，其余均未檢出。

2.8 準確度 混合對照品溶液：取2.5項下的對照貯備液1 mL至10 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得。平行配制3份。

分別取9份馬波沙星原料(企業1，批號171202)各0.1 g，依次精密加入上述各混合對照品溶液0.08、0.1、0.12 mL，配制成相當于80%、100%和120%限度的混合對照品溶液各3份。按2.1項下色譜條件進樣測定，結果為：甲醇的平均回收率為113.3%(RSD=6.8%)；乙醇的平均回收率為116.4%(RSD=3.7%)、乙腈的平均回收率為109.7%(RSD=4.0%)、二氯甲烷的平均回收率為115.6%(RSD=5.9%)、苯的平均回收率為103.3%(RSD=6.7%)、甲苯的平均回收率為115.3%(RSD=6.2%)。

2.9 穩定性 取2.2.2項下對照品溶液4份，分別于0、6、12和24 h按2.1項下方法測定，記錄6種殘留溶劑的峰面積，考察溶液的穩定性。甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯和甲苯峰面積的RSD分別為0.9%、1.0%、1.5%、1.6%、2.0%和0.9%，各待測成分色譜峰面積的RSD≤2.0%。說明該溶液在24 h內穩定性良好。

2.10 供試品測試結果 取2個企業6批供試品，按2.1項下色譜條件分別進樣測定，按外標法以峰面積計算，結果見表2。

表2 馬波沙星殘留溶劑結果表Tab 1 Results of residual solvents in Marbofloxacin draw material.

測定過程中使用的色譜柱為DB-624/30 m,0.53 mm,3.0 μm。

3 討 論

3.1 溶劑的選擇 研究之初擬采用較環保且經濟的0.5 mol/L氫氧化鈉溶液作為溶劑[9]，但其在乙腈和二氯甲烷出峰處有干擾，因此，又考察N’N-二甲基甲酰胺(DMF)、N’N-二甲基乙酰胺(DMA)和二甲基亞砜(DMSO)，考慮到DMF毒性相對較小，最終采用DMF作為溶劑。

3.2 頂空平衡時間和平衡溫度的選擇 因本法采用DMF為溶媒，沸點較高，為保證馬波沙星原料中的殘留溶劑能更好的釋放達到平衡，擬采用較高的平衡溫度，考察100、105、110、115 ℃，平衡15、20、25、30 min的殘留溶劑結果，結果表明：固定平衡溫度為105 ℃時，20 min之后隨平衡時間延長，供試品中殘留溶劑量無明顯增加，確定平衡時間為20 min；固定平衡時間為20 min，兩個企業供試品中乙醇和甲苯的檢出量隨平衡溫度增加而增加，在105 ℃之后趨于平衡，但企業1供試品隨平衡溫度增加而顏色加深明顯，為防止因供試品降解而產生乙醇，最終確定平衡溫度為105 ℃。

3.3 結果判定 根據VICH和《中國獸藥典》2015年版附錄規定，甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯和甲苯的殘留限度分別為：不得超過0. 3%、0. 5%、0.041%、0.06%、0.0002%和0.089%[7-8]。實際測定過程中若殘留溶劑峰面積低于檢測限，判為未檢出；殘留量低于限度判為符合規定。本試驗結果表明，2個生產企業的6批供試品檢測結果均符合規定。

綜上所述，本方法簡單、靈敏、準確、可操作性強，可以用于馬波沙星原料藥中6種殘留溶劑的檢測。