豬δ冠狀病毒膠體金試紙條檢測方法的建立

張 敏，孔冬妮，李 建，于義娟，黃 濤，王碧群，石寶蘭，朱 薇，鄭良益，李婷婷，謝紅玲*

(1.國藥集團動物保健股份有限公司，武漢430075；2.中國獸醫藥品監察所，北京100081)

豬δ 冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)是一種引起豬腹瀉的重要傳染病原，對養豬業造成了巨大經濟損失，是當前豬病防控的重大難題。PDCoV于2012年首次被報道，由Woo 等通過流行病學調查在動物糞便中成功檢測到[1]。目前在我國豬病料中也檢出PDCoV，由該病流行趨勢推測近年在我國爆發的可能性是存在的[2]。PDCoV感染后豬出現厭食、嘔吐、嚴重腹瀉和脫水等臨床癥狀，與豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)及豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV)等感染十分類似，給臨床診斷帶來極大困難，因此急需研究開發高效、準確、快速的抗原診斷方法[3-4]。膠體金免疫層析技術具有簡單、快速、靈敏、可現場操作等優點，目前已經被廣泛應用。本研究旨在研制PDCoV的免疫膠體金試紙條，實現臨床PDCoV的快速準確檢測，為豬腹瀉病防控奠定堅實基礎。

PDCoV為單股正鏈RNA病毒，含9個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，基因共編碼4個結構蛋白，分別為棘突蛋白S (spike)、囊膜蛋白E (envelope)、膜蛋白M (membrane)和核衣殼蛋白N (nucleocapsid)[5]。其中N蛋白是一種磷酸化的多功能結構蛋白，保守性強，在感染早期的病豬血清中可檢測到高水平的N蛋白抗體[6-7]，因此可將N蛋白作為PDCoV感染早期血清學診斷的靶標蛋白。本實驗構建表達和純化了有生物活性的PDCoV N蛋白，以其作為免疫原免疫小鼠，制備其單克隆抗體(Monoclonal antibodyies, McAbs)，同時應用膠體金免疫層析技術，成功建立PDCoV免疫膠體金試紙條快速檢測方法，助力PDCoV的臨床診斷及流行病學調查。

1 材料與方法

1.2 PDCoV N蛋白表達載體的構建與蛋白表達純化

1.2.1 引物設計 根據GenBank 中登錄的PDCoV1601株病毒序列設計RT-PCR 引物，預期擴增片段為1029 bp。引物序列為：PDCoV-NF：5'-TTTTCTCGAGATGGCCGCACCAGTAGTCCCTA￣CTACTG-3' (XhoI)；PDCoV-NR：5'-AAAA￣AAGCTTCTACGCTGCTGATTCCTGCTTTATCT￣CAA-3' (Hind III)。

1.2.2 PDCoV中N基因的擴增及重組表達質粒的構建 參照RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA并以其為模板，按上述引物擴增PDCoV的N基因。RT-PCR 的反應參數是：94 ℃預熱3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火溫度30 s，72 ℃延伸2 min(從第二步94 ℃變性到第四步72 ℃延伸進行35個循環)，72 ℃延伸10 min。回收純化的PCR 產物經XhoI 和Hind III 酶切后克隆至pCold 1 載體中，構建重組表達質粒pCold 1-N。

1.2.3 重組PDCoV N蛋白的表達、純化及鑒定 將pCold 1-N轉化至受體菌DH5a，待OD600nm達到0.4～0.5時，IPTG 誘導表達，將BL21誘導前的培養物、離心上清、超聲破碎后的菌體和上清進行SDS-PAGE電泳。表達的上清再過Ni柱進行純化，分別收集流穿液和各洗脫峰。并將各樣品進行SDS-PAGE電泳。同時將純化前后的樣品進行SDS-PAGE電泳、轉膜，加入合適稀釋倍數的陽性豬血清作一抗，用羊抗豬IgG-HRP為二抗，進行Western Blot鑒定。

1.3 單克隆抗體的研制

1.3.1 動物免疫 將一定量的PDCoV N蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合并完全乳化后，小鼠腹股溝兩側靠近淋巴結區和頸部皮下多點免疫，每只50μg/0.5mL;21 d后2免，免疫劑量為首次免疫的一半，佐劑用弗氏不完全佐劑;間隔21 d后3免，免疫劑量和佐劑同2免;10 d之后采用腹腔注射進行加強免疫，劑量同首免，3 d后融合。

This room is twice as large as that one. 這個房間是那個房間的兩倍大。

1.3.2 細胞融合 按照常規方法無菌采取小鼠的脾細胞，與骨髓瘤細胞按10∶1比例混合，用PEG1450進行融合，將融合之后的細胞加入鋪好飼養細胞的96孔板中。

1.3.3 雜交瘤細胞株篩選 利用間接ELISA法和間接免疫熒光法對所培養的雜交瘤上清進行檢測，有限稀釋法對檢測陽性的雜交瘤細胞進行至少三次以上的克隆直至陽性率為100%為止。

1.4 單克隆抗體的鑒定

1.4.1 腹水的生產及其純化 選擇12周齡以上的雌性BALB/c小鼠，腹腔注射單克隆雜交瘤細胞，7 d之后收取小鼠腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化腹水。

1.4.2 單克隆抗體的亞類測定 按照洛陽賽爾維公司單抗亞類試劑盒說明書進行單克隆抗體亞類的測定。

1.4.3 單克隆抗體特異性鑒定 將PDCoV、TGEV、PEDV分別接種長滿單層的PK1細胞、Vero細胞、ST細胞的96孔板中，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養72 h后用冷丙酮固定；以PDCoV N蛋白單克隆抗體作為一抗，FITC標記的抗鼠IgG作為二抗進行間接免疫熒光檢測，于熒光顯微鏡下觀察試驗結果。

1.5 免疫膠體金試紙條的制備及檢測

1.5.1 豬δ冠狀病毒膠體金快速檢測試紙條的制備用檸檬酸三鈉還原法制備25 nm 的金顆粒溶液，標記量為30 μg/mL膠體金溶液的單克隆抗體E8，攪拌30 min，再加入終濃度20%的PEG 20000穩定未結合的膠體金顆粒，8700 r/min離心30 min，棄上清，再用金標緩沖溶液定容至2 mL。標記好的膠體金溶液均勻涂布于金標墊上，37 ℃烘干2 h備用。再將羊抗小鼠IgG二抗和單克隆抗體A10分別以1 mg/mL濃度包被硝酸纖維素膜作為質控線和檢測線，37 ℃烘干2 h備用。將準備好的硝酸纖維素膜、樣品墊、金標墊和吸水紙按順序粘貼到背襯板上，切條機切割成4 mm條，組裝成檢測試紙條。

1.5.2 豬δ冠狀病毒膠體金快速檢測試紙條檢測

1.5.2.1 試紙條敏感性檢測 將105TCID50/mL的PDCoV病毒液用0.01 mol/L的PBS進行1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000系列稀釋，加樣量為0.1 mL/孔，分別用本試紙條進行檢測，評判試紙條檢測敏感性。

1.5.2.2 試紙條特異性檢測 取PEDV、TGEV、豬瘟病毒、豬圓環病毒、PDCoV陰性對照樣品，分別用本試紙條進行檢測，評判試紙條特異性。

2 結果與分析

2.1 PDCoV重組N蛋白表達及鑒定

2.1.1 PDCoV N基因的PCR擴增 PCR擴增出PDCoV N蛋白基因片段，電泳檢測結果(圖1)顯示，目的基因PDCoV N蛋白基因片段長度為1029 bp，與預期結果相符。

1-12：PDCoV N gene；M：Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker圖1 PDCoV N基因PCR擴增圖Fig 1 The PCR results of PDCoV N gene

2.1.2 PDCoV N蛋白表達、純化及鑒定 SDS-PAGE電泳結果(圖2、圖3)顯示，表達純化后的N蛋白分子量大小約為41 kD，與預期重組N蛋白分子量一致。同時重懸的菌體碎片和上清的條帶顏色深度相似，判定表達的N蛋白為分泌型表達。Western Blotting結果進一步表明，重組質粒樣品孔出現一條與目的蛋白大小相同的條帶，表明該重組N蛋白具有反應原性(圖4)。

1：誘導表達前菌體；2：誘導表達前上清；3：誘導表達后破碎菌體重懸；4：誘導表達后上清；M：PageRuler 非預染蛋白Marker1：Bacteria protein before induction；2：Supernatant before induction；3：Supernatant of the bacteria lysate after induction；4：Supernatant after induction；M：PageRuler unstained protein ladder圖2 PDCoV N蛋白表達各成分鑒定圖Fig 2 Identification of PDCoV N protein

1：PDCoV N蛋白純化前；2：流穿雜蛋白樣；3-6：各洗脫時間段收獲PDCoV N蛋白樣；M：PageRuler 非預染蛋白Marker1：Unpurified PDCoV N protein；2：Impure protein；3-6：Purified PDCoV N protein；M：PageRuler unstained protein ladder圖3 PDCoV N蛋白過柱純化鑒定圖Fig 3 Identification and purification of PDCoV N protein

1：純化前樣；2：純化后樣；M：PageRuler 預染蛋白Marker1：Unpurified PDCoV N protein；2：Purified PDCoV N protein；M：PageRuler prestained protein ladder圖4 PDCoV N蛋白純化Western Blot鑒定圖Fig 4 Western Blot identification of purified PDCoV N protein

2.2 單克隆抗體研制及鑒定 共篩選2株分泌PDCoV N蛋白抗體單克隆雜交瘤細胞株，分別命名為E8和A10。

2.2.1 單克隆抗體亞類測定 E8亞類是IgG2a，A10亞類是IgG1。

2.2.2 腹水的純化 將純化的抗體進行SDS-PAGE分析，結果如圖5，單克隆抗體重鏈大小為50 kD左右，輕鏈大小為25 kD左右。

1：E8單抗；2：A10單抗；M：PageRuler 非預染蛋白Marker1：Monoclonal antibody E8；2：Monoclonal antibody A10；M：PageRuler unstained protein ladder圖5 PDCoV N蛋白單抗純化SDS-PAGE鑒定圖Fig 5 SDS-PAGE identification of purified McAbs against PDCoV N protein

2.2.3 單克隆抗體特異性鑒定 E8、A10單克隆抗體均能與感染PDCoV的PK1細胞反應，可見明顯綠色熒光，與陰性細胞無熒光。且單克隆抗體與感染TGEV、PEDV的細胞均不發生特異性反應，無熒光信號，說明E8、A10單克隆抗體只與PDCoV發生反應，與TGEV、PEDV均不發生反應，單克隆抗體特異性良好(圖6、圖7)。

A：感染PDCoV細胞孔；B：感染TGEV細胞孔；C：感染PEDV細胞孔；D：正常細胞對照A：Infected PDCoV；B：Infected TGEV；C：Infected PEDV；D：Negative control圖6 單克隆抗體E8特異性間接免疫熒光檢測結果(40×)Fig 6 Immunofluorescence assay(IFA) analyze the binding of antibody E8 and antigen(40×)

A：感染PDCoV細胞孔；B：感染TGEV細胞孔；C：感染PEDV細胞孔；D：正常細胞對照A：Infected PDCoV；B：Infected TGEV；C：Infected PEDV；D：Negative control圖7 單克隆抗體A10特異性間接免疫熒光檢測結果(40×)Fig 7 Immunofluorescence assay(IFA) analyze the binding of antibody A10 and antigen(40×)

2.3 免疫膠體金試紙條檢測方法的敏感性及特異性

2.3.1 試紙條檢測敏感性 105TCID50/mL的PDCoV病毒液分別進行1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000稀釋，其中1∶10、1∶100、1∶1000稀釋度檢測結果均為陽性，1∶10000稀釋檢測結果為陰性，本試紙條檢測PDCoV的最低限為100 TCID50，試紙條敏感性檢測結果見圖8。

1：1∶10稀釋；2：1∶100稀釋；3：1∶1000稀釋；4：1∶10000稀釋1：the dilution of 1∶10；2：the dilution of 1∶100；3：the dilution of 1∶1000；4：the dilution of 1∶10000圖8 試紙條敏感性檢測結果Fig 8 Sensitivity test of dipstick

2.3.2 試紙條檢測特異性 分別用本試紙條對豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬瘟病毒、豬圓環病毒、PDCoV陰性對照樣品進行檢測，結果均為陰性，表明該試紙條不與豬其他病毒反應，特異性好，試紙條特異性檢測結果見圖9。

1：豬流行性腹瀉病毒；2：豬傳染性胃腸炎病毒；3：豬瘟病毒；4：豬圓環病毒；5：陰性對照1：PEDV；2：TGEV；3：Swine fever virus；4：Porcine circovirus virus；5：Negative control圖9 試紙條特異性檢測結果Fig 9 Specificity test of dipstick

3 討 論

本研究成功構建了PDCoV N蛋白表達載體，獲得了純化的PDCoV N蛋白，以PDCoV N蛋白作為免疫抗原，通過常規的免疫方法制備單克隆抗體，雖然耗時長，但能在一定程度上增強免疫效果，制備出穩定性及特異性優良的單克隆抗體[8]。PDCoV N蛋白氨基酸組成保守性高，達到97.1%～100%[9-11]，本實驗制備針對PDCoV N蛋白的抗體對于病毒的早期診斷是切實有效的。本研究成功篩選到單克隆雜交瘤細胞株E8和A10，細胞連續傳代，長勢良好，抗體分泌能力穩定。間接免疫熒光試驗證實單抗鑒別PDCoV、PEDV、TGEV 病毒感染細胞的特異性良好，為我們進一步的構建免疫膠體金檢測方法提供了堅實基礎[12-14]。

本研究制備的PDCoV膠體金檢測試紙條敏感性及特異性良好，檢測方法準確、可靠、有效，后續需用于臨床糞便樣品的檢測評估，收集更為全面的臨床數據，進一步完善膠體金試紙條檢測方法。PDCoV臨床癥狀復雜多變，免疫膠體金試紙條檢測方法的建立從根本上解決檢測時間長，過程繁瑣等問題，具備快速確診、低成本、高敏感性等多種優勢[10-11，15]。本試驗成功建立了PDCoV免疫膠體金試紙條檢測方法，為臨床豬血清PDCoV快速檢測以及流行病學調查提供方便快捷檢測方法奠定了基礎。