泉州仿生栽培鐵皮石斛內生真菌的分離鑒定及抑菌研究＊

徐焰平 王翠玲＊

（泉州醫學高等專科學校檢驗預防學院，福建 泉州 362010）

鐵皮石斛是一種藥用植物，化學成分經藥理學研究具有提高免疫功能、抗腫瘤等作用[1]。內生真菌生物類群豐富，經研究發現于各種植物體內普遍存在，藥用植物內生真菌能產生與宿主相同或類似藥用活性成分[2]。前期有多個研究者從藥用植物鐵皮石斛中分離內生真菌，從中篩選出能夠產生抗菌、提高機體免疫力或抗腫瘤成分的內生真菌[3]。從中尋找新活性先導化合物，拓寬和豐富新藥源發現的渠道，可通過規模化的發酵獲取較多量的產物，用于新藥研發[4]。本項目從泉州仿生栽培的鐵皮石斛中分離出內生真菌，進行抑菌活性研究，并對具有抑菌活性的內生真菌進行鑒定。

一、材料與儀器

1.材料

龍眼樹上仿生態栽培的鐵皮石斛來自泉美生物科技有限公司，標準菌株金色葡萄球菌ATCC 25923、大腸桿菌ATCC 25922和蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579由本實驗室提供。

2.藥品和試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂、LB培養基購自廣東環凱生物科技有限公司、PBS緩沖液（pH值7.4）在本實驗室配置。ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’和ITS5 5'-GGAAGTAAAA GTCGTAACAAGG-3’由大連Takara公司合成。

3.儀器設備

生物安全柜、顯微鏡、培養箱、analytikjena EasyCycler PCR儀、analytikjena UVsolo toutch等。

二、實驗方法

1.內生真菌的分離

鐵皮石斛樣本采集到實驗室后應該于24h內進行內生真菌的分離。從采集的樣品中選取新鮮健康的鐵皮石斛，先用自來水沖洗干凈，去除表面雜土顆粒后自然晾干備用。根部和莖部剪成1cm左右的小段，葉片剪成0.5×0.5cm大小置于小燒杯中。在生物安全柜中，用75%酒精浸泡60s，接著用無菌水浸洗3次，再用3%次氯酸鈉（有效氯）溶液浸泡4min，最后再用無菌水浸洗3次。濾干余液后用鑷子將樣本置于含鏈霉素（50～100mg/L）和青霉素（100～300mg/L）馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中，每直徑為9cm的培養皿放入6～8個組織塊。放入培養箱28℃培養5～10d，待樣本周圍長成肉眼可見的菌落時，用接種鉤挑取菌落邊緣的菌絲體移入另一個平板上，繼續培養。將分離到的優勢菌種利用平板劃線法進一步行進純化分離，連續富集培養3次。當富集培養不再出現雜菌時，再一次用平板劃線法進行最后一輪菌株分離純化，重復3次。肉眼觀察真菌的特征，選擇生長優良的菌株。將得到的優勢菌株接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面上，28℃培養3～5d，放在4℃冰箱保存備用[5]。

2.抑菌活性篩選

將上述分離到的內生真菌接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中，放置于培養箱28℃培養5d。用無菌打孔器打出直徑6mm的菌餅，放置于裝有50mL液體馬鈴薯葡萄糖培養基的250mL錐形瓶中，放置于恒溫振蕩培養箱中培養5d后制成內生真菌發酵液。培養條件為：溫度28℃，轉速200rpm。利用杯碟法（瓊脂擴散法）測定內生真菌對金色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽包桿菌三種細菌的抑菌功能，分別吸取0.1mL三種待測細菌的菌液到LB平板表面，用無菌玻璃涂布棒在培養基表面輕輕地涂布均勻，室溫下靜置5～10min。用滅菌鑷子將無菌牛津杯置于平板中預定位置，再用鑷子尖端輕輕按壓牛津杯上部使之與培養基表面緊貼。往牛津杯中加入100μL內生真菌發酵液，置于恒溫培養箱中37℃培養18～24h，測量抑菌圈直徑，并計算其平均值，每個實驗重復三組[6]。

3.內生真菌的鑒定

3.1 菌株形態學觀察。挑取已分離純化具有抑菌活性的QZQM08的新生菌絲，接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中央，倒置于恒溫培養箱中28℃培養，觀察該菌的菌落形態，并記錄其菌落大小、正反面的顏色、邊緣菌絲形態及是否產生孢子和孢子的顏色等特征。并利用銅圈進行小培養，觀察真菌的結構及生長發育過程。根據菌落培養特征和顯微鏡下菌絲和孢子的形態特對分離菌株進行初步鑒定[7]。

3.2 菌株的分子鑒定。按2.2的方法進行真菌菌種培養，用改進的蛋白酶K和苯酚抽提法進行基因組DNA的分離與純化。利用通用引物ITS4和ITS5進行ITS區域的擴增，擴增條件為：反應體系25uL，ddH2O 16.75μL；10×PCR Buffer 2.5μL；dNTP 2.5μL；ITS4和ITS5各1μL， 模板DNA luL（20～50ng）；TaKaRa rTaq酶0.25μL。 在analytikjena EasyCycler PCR儀按以下程序進行PCR擴增：95℃預變性5min使模板變成單鏈，95℃變性30S，將反應體系溫度下降至55℃退火30S，再升溫至72℃延伸1min，循環次數30次；最后在72℃延伸5min。用生工生物工程（上海）股份有限公司的3S柱式離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒，按說明書的要求進行的擴增產物的純化[8]。將上一步提取的DNA送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。完成測序后將所得核酸序列提交至NCBI進行Blast比對，下載軟件MEGA version 5.0進行NJ系統發育樹構建[9]。

三、結果與討論

1.仿生栽培鐵皮石斛內生真菌的分離

經表面消毒的鐵皮石斛組織塊在培養3～4d后，逐漸觀察到有菌絲從組織塊的切口處長出。經過分離，從泉州地區仿生栽培鐵皮石斛中分離到內生真菌21株，從葉片中分離到10株（47.62%），從莖中分離到6株（28.57%），從根中分離到5株（23.81%）。

2.內生真菌的抑菌活性

通過抑菌活性實驗，發現分離到的內生真菌有17個菌株的發酵液至少對一種以上的供試細菌有抑菌活性，其中內生真菌QZQM08對三種供試細菌的抑菌活性最強（如表1所示）。

表1 內生真菌發酵液的抑菌活性

3.內生真菌QZQM08的菌落形態特征和鑒定結果

將抑菌活性最強的內生真菌QZQM08進行大培養和小培養。在平板上該菌菌落顏色為綠色，屬于快速生長真菌，呈放射狀生長形成密集的氈狀，表面質地疏松、干燥、不透明。通過小培養直接觀察該菌菌絲透明有隔，有豐富的分枝，分生孢子梗呈樹枝型。分生孢子呈圓形至橢圓形，單生或串生，初步判定為木霉屬真菌。對PCR產物進行測序，并將所得核酸序列提交至NCBI進行Blast比對，選取GenBank中與QZQM08的ITS序列同源性高的系列菌株用于系統發育分析。結果表明，與QZQM08相似性較高的序列主要分布在木霉屬。