基于網絡藥理學探討疏肝益陽膠囊治療勃起功能障礙的作用機制*

嚴 云 李博懌 王雅琦 趙蔚波 董麗丹 鄭燕飛

北京中醫藥大學，國家中醫體質與治未病研究院（北京 100029）

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）指男子在性刺激下，陰莖持續地不能達到或維持足夠硬度的勃起以完成滿意性生活，病程達3 個月以上[1]。中醫將ED稱為 “陽痿”。疏肝益陽膠囊是中醫男科學的創始人之一、學科帶頭人王琦院士根據 “陽痿從肝論治” 的理論研制的，由蒺藜、柴胡、蜂房等15 味中藥組成[2]。前期動物實驗和臨床實驗均證實疏肝益陽膠囊可顯著改善勃起功能，尤其對心理性及輕度動脈性勃起功能障礙具有良好療效[3]。本研究利用網絡藥理學方法研究疏肝益陽膠囊治療ED 的作用機制，為后續進行疏肝益陽膠囊治療ED 的科學研究提供理論參考，并降低篩選靶點和作用通路所需的研究成本。

資料與方法

一、疏肝益陽膠囊活性成分收集與靶點預測

通過TCMSP[4]（https://tcmspw.com/tcmsp.php）、中國天然產物化學成分庫（http://pharmdata.ncmi.cn/cnpc）和TCMID[5]（http://119.3.41.228:8000/tcmid）等數據庫對疏肝益陽膠囊的化學成分進行收集，并檢索相關文獻[6-9]作為補充。再利用TCMSP 收集這些化學成分所對應的靶點蛋白，最后利用UniProt[10]（https://www.uniprot.org）數據庫，將靶點蛋白轉化為對應的基因名。

二、疏肝益陽膠囊與ED 的交互靶點

在DrugBank[11]數 據 庫（https://www.drugbank.ca）、GeneCards[12]數據庫（https://www.genecards.org）、OMIM[13]數據庫（https://www.omim.org）和TTD[14]數據庫（https://db.idrblab.org/ttd）中進行ED 相關基因的查詢，并匯總去掉重復基因。最后，將疏肝益陽膠囊靶點與ED 靶點一同導入Veney2.1 軟件，繪制韋恩圖，得到疏肝益陽膠囊與ED 的交互靶點。

三、“藥物- 成分- 靶點” 網絡構建

將交互靶點及其對應的化學成分文件導入Cytoscape 3.8 軟件，繪制 “藥物- 成分- 靶點” 網絡圖，并應用 “Analyze Network” 功能獲得網絡拓撲屬性值。

四、蛋白互作網絡（PPI）構建

利用String 數據庫（https://string-db.org）對交互靶點進行蛋白互作分析，并把文件導入Cytoscape 3.8 中，繪制PPI 圖。

五、生物過程分析

在WebGestalt 2019[15]平 臺（http://www.webgestalt.org），對交互靶點進行GO 和KEGG 富集分析，其中GO 功能分析包括生物學過程（Biological Process，BP）、細胞成分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF），各自描述了基因產物可能行使的分子功能，所處的細胞環境以及參與的生物學過程。

結 果

一、疏肝益陽膠囊與ED 的交互靶點篩選

篩選出116 個藥物口服生物利用度[16]（OB）≥30 和類藥性[17]（DL）≥0.18 的疏肝益陽膠囊化學成分，再將這些化學成分所對應的靶點匯總去重，最終得到266個中藥靶點。將各數據庫中檢索到的ED 疾病靶點匯總去重，得到1094 個靶點。最后，將疏肝益陽膠囊靶點同ED 靶點繪制韋恩圖，獲得83 個交互靶點，即為疏肝益陽膠囊治療ED 的潛在作用靶點，見圖1。

圖1 疏肝益陽膠囊- 勃起功能障礙靶點韋恩圖

二、“藥物- 成分- 靶點” 網絡構建

通過Cytoscape3.8 軟件繪制疏肝益陽膠囊治療ED 的 “藥物- 成分- 靶點” 網絡圖，見圖2。圖中字體的大小、節點的大小和顏色的深度均與degree 值成正比關系，degree 值排名前10 的靶點，見表1； 再根據Gene Cards 數據庫中的基因與勃起功能障礙疾病相關性（Relevance score）對表1 中的基因進行排序，推測雄激素受體（AR）、一氧化氮合酶2（NOS2）、一氧化氮合酶3（NOS3）等可能為疏肝益陽膠囊治療ED 的重要作用靶點，見表2。根據degree 值大于10 的化學成分，可推測出quercetin、kaempferol 和beta-sitosterol 等化合物可能為疏肝益陽膠囊治療ED 的主要化學成分，見表3。

表3 “藥物- 成分- 靶點” 網絡圖中的主要化學成分

圖2 疏肝益陽膠囊治療ED 的 “藥物- 成分- 靶點” 網絡圖

表1 “藥物- 成分- 靶點” 網絡圖中的重要靶點

表2 疏肝益陽膠囊治療ED 的重要靶點按相關性分數排序

三、PPI 網絡構建

通過Cytoscape3.8 軟件繪制交互靶點蛋白互作網絡圖，見圖3。結果顯示，白細胞介素6（IL-6）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、腫瘤壞死因子（TNF）和和胱天蛋白酶3（CASP3）等靶點蛋白基因degree 值較大，表明這些靶點與其他靶點相互作用較強，在網絡中發揮重要作用。

圖3 疏肝益陽膠囊治療ED 的蛋白互作網絡圖

四、GO 和KEGG 富集分析

通過WebGestal 平臺分析得到12 個最相關生物過程（Biological Process，BP）；19 個最相關細胞成分（Cellular Component，CC）；16 個分子功能（Molecular Function，MF）。其中BP 包含生物調節、對刺激的反應、代謝、多細胞生物、細胞通訊等生物過程；CC 包含膜、內膜系統、細胞外隙、核等細胞組分；MF 包含蛋白質結合、離子結合、分子轉導活性等分子功能，見圖4。

圖4 GO 富集分析

通過WebGestal 平臺進行KEGG 富集，選擇加權集合覆蓋（Weighted set cover）分析出7 條最相關信號通路，包括瘧疾、糖尿病并發癥中的晚期糖基化終產物及其受體（AGE-RAGE）、白細胞介素17（IL-17）、核因子κB（NF-κB）和血流剪切應力與動脈粥樣硬化等信號通路，見圖5。

圖5 KEGG 富集分析

討 論

古代醫家對陽痿的認識和治療，存在多種不同的學術觀點。其中補腎法和從肝論治最具影響力，尤其是補腎法在歷代中醫治療陽痿上取得了諸多成果[18]。但現代以來，王琦院士發現陽痿患者中青壯年并不少見，其年腎氣本應旺盛，故臨床用補腎法往往收效不顯[19]，說明隨著人們的生活壓力和身體素質的變化，陽痿的病因病機同樣也在變化。疏肝益陽膠囊是王琦院士基于“肝郁腎虛血瘀” 的病機所研制的，該藥具有 “疏肝解郁，活血通絡，補腎,興陽振痿” 的作用。前期研究證實，疏肝益陽膠囊可改善性欲及射精功能，并提高抗疲勞能力。其機理與提高雄激素、促腎上腺皮質激素水平和縮小陰莖靜脈管腔直徑及減慢陰莖靜脈回流速度有關[20]。

本研究通過網絡藥理學方法發現疏肝益陽膠囊治療ED 的興陽振痿、活血通絡功能，其機制可能與AGE-RAGE、IL-17、NF-κB、血流剪切應力與動脈粥樣硬化等信號通路相關。晚期糖基化終末產物（AGEs）通過蛋白質，脂質和核酸等非酶促糖基化和氧化作用產生，主要是由于衰老和某些病理狀況（例如高血糖、腎功能衰竭癥） 引起[21]。AGEs 作用于細胞表面的受體（RAGE）時，可刺激內皮細胞分泌白細胞介素（IL-8），并上調IL-8mRNA 的表達，IL-8 對炎癥和免疫過程有重要的調節作用[22]。有研究表明，糖尿病狀態下AGEs與RAGE 的結合效應可以引起大鼠陰莖海綿體組織中氧自由基的產生增多，抗氧化能力下降，從而加劇ED的發生發展[23]。IL-17 是一個重要的促炎癥細胞因子，在多種炎性反應及自身免疫性疾病病理過程中發揮關鍵作用，IL-17 通過其相應的受體發出信號，激活包括NF-κB、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）等在內的下游信號通路[24]。NF-κB 是細胞內重要的轉錄調節因子，NF-κB信號通路在復雜的炎癥細胞因子網絡中起著中心調節的作用，不僅參與機體免疫、炎癥、代謝、遺傳等過程，還在細胞增殖、分化及凋亡的發生發展中也扮演著重要角色[25]。血流剪切應力是指血流施加在血管壁內皮表面的摩擦力，其與血液特性、血流速度和血管形態有密切關系。剪切應力對血管內皮細胞形態、結構、功能的調節起主要作用[26]。Burnett[27]等研究表明陰莖脈管中血流誘導的流體剪切力能夠激活NOS3 大量合成內皮來源的一氧化氮（NO），進而維持完全勃起。由 “藥物- 成分- 靶點” 網絡圖可見疏肝益陽膠囊治療ED 具有多成分、多靶點的特點，相對于單分子靶點藥物來說，疏肝益陽膠囊可同時調節疾病網絡系統中的多個環節。通過本次研究，為疏肝益陽膠囊在 “肝郁、腎虛兼血瘀證”所致陽痿和輕度動脈供血不足性陽痿的應用進一步提供了理論支持。但由于目前研究手段的局限性無法考慮到藥物在體內的代謝過程等因素，因此本研究結果還有待進一步的研究驗證。