白藜蘆醇通過降低氧化應激改善過氧化氫誘導精子活力和DNA 損傷*

吳海峰 李 曼 李玉靜 江 乾 李 亮 趙世彬 乜照燕**

1. 河北省胸科醫院檢驗科（河北石家莊 050021）；2. 河北醫科大學第四醫院生殖醫學科（河北石家莊 050011）

過度氧化應激可以對精子細胞造成損傷，影響精子活力，導致精子DNA 完整性降低，影響男性生育力[1]。白藜蘆醇（Resveratrol，RES）是一種天然多酚類物質，主要存在于虎杖、葡萄和紅酒中[2]。RES 具有多種生物學活性如抗腫瘤、抗炎、抗氧化等[3]。RES 化學結構中存在酚羥基，具有抗氧化作用，可以清除過氧化物減輕細胞膜脂質過氧化和各種活性氧產物對細胞的損傷[4]。鑒于此，本研究利用過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）建立精子氧化應激損傷模型，探討RES 對H2O2誘導精子氧化應激的保護作用，為男性不育抗氧化治療提供依據。

材料和方法

一、試劑和儀器

Percoll 細胞分離液購自Solarbio 公司 （Lot. No.5111042）；白藜蘆醇( VETEC，900386-5 G) 購自Vetec公司；伊紅- 苯胺黑染液(20201201)、精子吖啶橙購自華康生物工程公司。離心機購自eppendorf 公司，相差顯微鏡購自Olympus 公司，熒光顯微鏡購自Olympus公司，酶標分析儀購自Biotek 公司。

二、精液收集和處理

收集2019 年12 月于河北醫科大學第四醫院生殖醫學科精液常規檢查正常精液標本。患者年齡25～32歲，平均年齡(29.0±2.4) 歲。所有樣本均在禁欲2-7 天后通過手淫法收集，收集精液于干凈容器后立即送精液檢查室，在室溫下放置30 min，待精液液化后，依據WHO 人類精液實驗室檢驗手冊第五版進行精液參數常規分析[5]，本項研究經我院倫理委員會批準（倫理編號：2020KSO29）。

三、H2O2 誘導精子毒性作用和RES 保護作用

取上述精液標本進行Percoll 密度梯度離心。具體操作如下：準備梯度液，40% Percoll 液1.5 ml+80% Percoll 液1.5 ml，將精液2 ml 緩慢加入15 ml 尖底離心管，1 200 r/min 離心15 min，棄上清，底層白色沉淀即為分離出精子。棄上清后底層精子加入2 ml 培養液，1 200 r/min 離心5 min，洗滌1 次后加入培養液調整精子濃度為20×106/ ml，處理后精液每份取0.1 ml，加入終濃度0、25、50、75、100 μmol/L H2O2置5% CO2，37℃培養箱繼續培養24 h，每組設5 個標本，計數前向運動精子和總活力精子百分比，選擇H2O2濃度建立精子氧化應激損傷模型。

選用不同濃度5、10、25、50、75 μmol/L RES 和上述三中確定H2O2濃度，置5% CO2，37 ℃培養箱共培養24 h，每組設5 個標本，計數精子前向運動和總活力精子百分比，確定RES 最佳改善濃度。

四、實驗分組和各項相關指標測定

根據上述確立H2O2和RES 濃度將實驗分為3 組：對照組(CON)：處理后精液不做處理，置5% CO2，37℃培養箱培養24 h；H2O2模型組(H2O2)： 加入H2O2（H2O2濃度按三確定），置5% CO2，37℃培養箱培養24 h；RES+H2O2改善組(RES+H2O2)，加入H2O2和RES（H2O2和RES 濃度按三確定），5% CO2，37℃培養箱培養24 h；待處理后檢測各組精子膜完整性、精子氧化應激產物MDA 和精子DNA 損傷。

（一）伊紅- 苯胺黑法評估精子膜完整性

使用移液器吸取10 μl 各組精液樣本于干凈EP管，加入10 μl 伊紅- 苯胺黑溶液在EP 管內充分攪拌混勻，放置60 s。滴加上述精液和伊紅- 苯胺黑染色液混合液10 μl 于載玻片上，制成涂片，自然干燥后100×油鏡下觀察。使用血細胞計數器來計數染色（精子膜不完整，淡紅色）和不染色（精子膜完整，白色）細胞數目。為了降低誤差，每張玻片評估200 個精子。

（二）氧化應激指標丙二醛測定

精子膜脂類過氧化反應的程度一般用氧化應激反應產物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)表示，MDA 測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法，本研究采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒(KGT004-1)測定。測定管為0.1 ml 取待測精液，按照說明書操作設空白管、標準管及標準空白管，分別加入相應試劑，450 nm 處BioTek 酶標儀測定。結果用nmol/ml 表示。

（三）精子DNA 損傷測定

采用精子吖啶橙(acridine orange，AO) 染色法，取10 μl 各組精子凃片，室溫自然晾干后甲醇固定。AO 染液新鮮配制，染色5 min 后緩慢流水沖洗，室溫干燥后用熒光顯微鏡于×400 觀察，激發濾光片使用波長460～490 nm，快速計數，每個視野下觀察時間不超過40 s。每個樣本觀察計數不少于10 個視野。判斷標準：正常精子為正常雙鏈DNA，呈綠色，損傷精子呈紅色或黃色。計數200 條精子中綠色(G)、紅色(R)和黃色(Y)精子數，計算出DNA 完整精子百分率。

五、統計學方法

用Excel 表格錄入數據，采用雙錄入法核實無誤后，將數據應用SPSS21.0 軟件進行統計學處理，計量資料數據用均數±標準差x±s表示，均值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法，以P＜0.05 表示組間比較差異具有統計學意義。

結 果

一、H2O2 導致精子前向運動精子和總活力下降

不同濃度H2O20、25、50、75、100 μmol/L 處理后，結果顯示：與對照組比較，隨著H2O2濃度增加，精子前向運動和總活力隨著H2O2濃度增加逐漸降低，呈劑量依賴關系。與未加H2O2組相比，50、75、100 μmol/L 差異有統計學意義（P＜0.05，表1），選擇100 μmol/L 為后續實驗藥物濃度。

表1 H2O2 對處理后精子前向運動和總活力影響(x±s)

二、RES 改善H2O2 導致精子活力下降

加入不同濃度RES 和H2O2共同作用后，結果顯示：隨著RES 濃度增加，精子前向運動和總活力百分比逐漸增加，RES 濃度50 μmol/L 時，精子前向運動和總活力逐漸增加，差異有統計學意義(P＜0.05)，提示RES預處理對H2O2損傷后精子活力有改善作用。在RES 濃度50 μmol/L 效果最佳。選擇50.0 μmol/L 為后續實驗藥物濃度（P＜0.05），見表2。

表2 RES 預處理對H2O2 誘導處理對精子前向運動和總活力影響(x±s)

三、RES 改善H2O2 導致精子氧化應激、精子膜完整性改變和精子DNA 完整性

與RES+H2O2相比，H2O2組MDA 水平增高，精子膜完整性百分比降低，精子DNA 完整性百分比降低，結果均有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 RES 預處理對H2O2 誘導精子氧化應激水平影響(x±s)

討 論

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是機體正常有氧代謝的中間產物，在正常條件下，機體保持氧化與抗氧化系統平衡，當機體遭受各種內外環境有害刺激時，機體可產生氧化和抗氧化系統失衡，發生氧化應激損傷。氧化應激損傷可以造成精子結構和精子功能損害，是引起男性不育病因之一[6]。男性不育與其精漿中活性氧水平密切相關，過量活性氧會對精子細胞膜和精子DNA 造成嚴重的氧化損傷，從而引起精子膜脂質、超微結構損傷，導致精子運動能力下降[7]。此外，在輔助生殖技術（Assisted Reproductive Technology，ART）精子優選過程多次離心會刺激精子產生大量ROS 誘發氧化應激。因此如何防范氧化應激導致男性生育力降低和減少離心過程中過量ROS 生成，對改善男性精子水平和提高ART 妊娠結局意義重大。目前應用抗氧化劑主要有維生素C、維生素E、輔酶Q10、蝦青素等，這些人工合成抗氧化劑具有相對分子質量大、不易吸收的缺點。因此我們需要尋找一種新的天然的、無生物危害、易于吸收抗氧化劑，以保護精子免受氧化應激損傷。

RES 是在葡萄皮、虎杖等植物提取到的非黃酮類多酚化合物，分子式C12H14O3，分子質量228.25ku，它在葡萄籽提取物、葡萄汁和葡萄皮中含量豐富。目前，以其來源廣泛、高效、低毒等特性受到研究者重視。RES能有效清除過氧化物和羥基，具有強大抗氧化作用，防止氧化應激對細胞造成損傷[8]。RES 能夠激活體內抗氧化酶系統超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）等，具有細胞內抗氧化活性[9]。另外研究發現RES 具有增強細胞抗氧化功能，可以保護細胞免受氧化應激損傷而減少細胞死亡[10]。RES在人類心血管疾病、糖尿病、神經退行性疾病等發揮重要作用[11]，但在精子方面作用研究較少。

故本研究建立了H2O2誘導精子氧化應激模型，探討了白藜蘆醇對H2O2誘導精子氧化應激模型的保護作用。本研究所用精子為處理后精子，經過梯度離心處理，精子前向運動精子一般都在90%以上。

有研究認為精子運動是精子氧化應激損傷最早而且最敏感的指標[12]。本研究結果顯示，H2O2添加抑制精子活力。隨H2O2濃度增加精子活力不斷下降，在100 μmo1/L 精子活力下降最明顯，由于精液計數存在一定誤差，本研究選用了一個使前向運動精子和精子總活力下降最大濃度100 μmo1/L H2O2作為精子氧化應激模型研究濃度。在RES+H2O2組，隨著RES 濃度升高，精子前向運動和總活力百分比得到提升，這一結果提示我們，適宜濃度RES 可提高H2O2誘導精子活力下降，其中50 μmol/L RES 濃度效果最佳，故選擇50.0 μmol/L 為后續實驗中最佳濃度。此外，研究還發現75 μmol/LRES 精子前向運動百分比和總活力百分比有稍微下降，是否RES 在高濃度會對精子活力產生抑制作用尚需進一步研究。

精子膜表面富含多聚不飽和脂肪酸，容易受到氧化應激攻擊，使精子膜結構發生損傷進而影響精子活力和功能。RES 作為一種自由基清除劑，能有效地與脂質雙分子層中的自由基相互作用，并增強過膜流動性，穩定膜結構[13]，本研究顯示，H2O2處理后，導致精子膜完整性降低，RES 處理顯著抑制了H2O2誘導精子膜完整性降低，由此可見，RES 具有穩定精子細胞膜作用。

精子細胞質含量少，含有清除作用的細胞質內抗氧化酶含量低，對活性氧誘導的損傷極為敏感[14]。MDA 是氧化應激損傷過程中產生的主要產物之一，對精子細胞有明顯損傷作用，是引起不育常見代謝產物[15]。本研究顯示，H2O2處理后，MDA 明顯升高。與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。RES 加入抑制了H2O2誘導MDA產生，由此可見RES 添加抑制了H2O2誘導ROS 產生。

此外，精子DNA 完整性對于受精及胚胎發育是十分重要。本研究結果顯示H2O2處理后，精子DNA 損傷增加。精子DNA 外包被有魚精蛋白，染色質狀態高度致密，過量ROS 可以與DNA 親核基團反應，導致DNA鏈聚集并改變DNA 正常結構。有研究顯示氧化應激造可成精子核結構損傷，破壞DNA 雙鏈結構，精子DNA碎片化指數升高[16-17]。本研究顯示RES 加入顯著降低了H2O2誘導精子DNA 損傷升高。這可能與RES 降低氧化應激產物水平，避免了活性氧對精子的攻擊有關。已有研究證實精液冷凍保護液中添加RES 可以通過降低精子內ROS 水平，減少精子冷凍損傷，從而改善解凍后精子質量[18]。亦有研究證實RES 改善了弱精子癥患者精子活力、精漿鋅含量、精漿硬彈性蛋白酶以及精子頂體酶活性，推測可能與RES 的抗氧化作用有關[19]。此外，RES 可以減少化療藥物導致的精子氧化應激水平增加，能預防和緩解化療藥物對人精子造成的損傷[20]。

綜上所述，本研究證實RES 通過抗氧化改善了H2O2誘導的精子損傷。這一作用可能與白藜蘆醇抗氧化作用有關，其作用機制也是我們下一步研究的重點。未來研究將進一步闡明RES 改善氧化應激對精子的損害的機制和RES 應用安全性問題。由于RES 具有多種有益于人類健康的生物藥理活性，使其廣泛應用于醫藥、保健品和食品添加劑等領域。其在腫瘤、心腦血管疾病、炎癥等方面的治療及預防作用也越來越被人們認可，RES 臨床應用前景廣闊，有望成為一種男科領域抗氧化的新型藥物。