7 例外周血染色體結構異常患者的平衡型精子分析

韓小克 楊惠祥 李維釧 楊志偉 苑 輝 趙曉丹 李 慧 戴芳芳 鄭 波

邢臺不孕不育專科醫院（河北邢臺 054000）

根據《世界衛生組織男性不育標準化檢查與診療手冊》的病因分類，男性不育可分為17 種病因，其中由遺傳異常引起的染色體異常較已育男性高8~10 倍[1]。染色體結構異常的生殖細胞進行減數分裂會導致精子生成障礙、精子遺傳物質異常，從而影響妊娠結局。在選擇生育策略時面臨如下幾種倫理困境：嘗試自然懷孕，自然流產風險高；接受產前診斷可能面臨終止妊娠的決定；接受胚胎植入前遺傳學檢測（PGT），其標本取樣和診斷技術仍然存在某些局限性和缺陷，費用相對昂貴[2]。不同類型染色體結構異常的生殖細胞進行減數分裂時，形成正常精子的比例不同，研究染色體異常的攜帶者在減數分裂中形成的配子類型，尤其是正常或平衡型精子所占比例，可為遺傳咨詢、生育指導提供信息。

對象和方法

一、研究對象

選擇2019 年1 月至2021 年6 月期間就診于邢臺不孕不育專科醫院并經外周血染色體核型分析確診的7 例染色體結構異常的男性患者，詳見表1。對照組選擇同期就診于本院染色體正常的不育男性（對照組1）和染色體正常的生育男性（對照組2）。所有患者均知情同意并經過醫院倫理委員會討論通過。

表1 7 例染色體異常患者病例資料

二、方法

（一）精液分析

禁欲2-7 天，手淫法獲取新鮮精液于潔凈容器內，放置于37。C 水浴恒溫箱內液化。精液液化后取10 μL涂片，以偉力精子檢測系統行精液分析，所有操作嚴格參照世界衛生組織《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5 版標準執行，分別記錄精子濃度、前向運動精子。

（二）染色體核型分析

采集外周血淋巴細胞培養72 小時后，采用G 顯帶技術進行染色體制備，GLS-120 全自動分析儀掃片后，計數20 組，分析5 個核型。按人類細胞學國際命名體制（ISCN2016）進行染色體核型分析和命名。

（三）染色體探針

美國Vysis 公司生產的染色體特定位點DNA 序列特異性的熒光素標記探針。包括：1-22 號、X、Y 染色體著絲粒探針（CEP），1-22 號染色體長臂亞端粒探針（Tel q），1-12 號染色體短臂亞端粒探針（Tel p），基因特異性探針LSI13q14。

（四）檢測方法熒光原位雜交技術（FISH）

制片：精液樣本液化后，取1-2 mL 移入離心管中與7 mL 1×PBS 溶液混勻洗滌，1500 轉/ 分鐘離心10 分鐘，棄上清，加適量1×PBS(約0.2-1 mL)重懸沉淀，制備精子懸液。取100 uL 精子懸液均勻分散在載波片上，室溫風干后在卡洛氏固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）浸泡10分鐘，取出玻片風干后放入0.05M 流蘇二糖醇（DTT）溶液中，處理10 分鐘后取出，依次放入75%酒精、90%酒精、100%酒精梯度脫水各2 分鐘，60℃烤片1 小時，用0.1μg/uL RNA 酶溶液于37℃處理玻片標本區30 分鐘，酒精梯度脫水風干后將載玻片放入75℃水浴預熱的變性液中變性5 分鐘，75%、90%、100%酒精梯度脫水各2 分鐘，室溫風干玻片。

雜交：按照說明書配制探針組合液，取5 uL 探針液于75℃水浴變性5 分鐘，將5 uL 已變性探針滴加到載玻片標本區并用蠟膜封片，載玻片放入濕盒中于37℃恒溫箱中雜交16 小時，雜交完成后用高鹽緩沖液洗脫去除背景和多余的探針液，75%、90%、100%酒精梯度脫水各2 分鐘，室溫風干玻片，滴加10 uL DAPI復染液（0.5mg/mL）在標本區并蓋上蓋玻片于暗處放置10 分鐘，通過FISH2.1 軟件用熒光顯微鏡在40 倍物鏡下拍照，每種探針根據染料顏色使用對應的慮色塊通道拍照，最后保存不同顏色組合探針熒光信號的疊加圖。

分析：在FISH 軟件中分析計數每個精子核中每種探針的熒光信號數。同一個精子核中每個探針信號均1個時，判斷為正常信號即染色體正常和（或）平衡型精子，否則為異常信號。對正常/ 平衡型精子、不平衡精子計數，計算正常/ 平衡型精子所占比例。

兩輪雜交操作中，進行第二輪雜交前充分曝光淬滅第一輪的雜交信號，且第二輪雜交信號計數分析是通過相同的坐標尋找到與第一輪相同區域的視野拍照保存圖片，并與第一輪保存的圖片對比分析進行熒光信號計數，避免第一輪雜交信號對第二輪雜交信號分析計數的影響。

（五）統計學分析

數據采用SPSS17.0 軟件進行處理，數據采用率(%)表示，組間數據比較通過χ2檢驗, 以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、精子FISH 結果

所有探針雜交率均在95%以上，熒光顯微鏡下精子FISH 結果，詳見圖1，圖2，圖3，圖4。病例1、病例2、病例3、病例4、病例5 正常和（或）平衡型精子率分別為27.98%（61/218）、28.94%（101/349）、40.26%（213/529）、25.71%（54/210）、34.10%（148/434）；復雜結構異常的病例6 正常和（或）平衡型精子率為10.95%（23/210）；羅伯遜易位病例7 正常和（或）平衡型精子率為85.77%（1 079/1 258）。染色體正常的不育男性組（對照組1）正常和（或）平衡型精子率為99.86%（13 232/13 250），染色體正常的生育男性組（對照組2）正常和（或）平衡型精子率為99.74%（12 346/12 378）。病例1 至病例7 與對照組比較，差異均具有統計學意義（P＜0.05），詳見表2。

表2 精子染色體FISH 結果

圖1 病例1 46,XY,t(1;3)(p32;p13) 精子FISH 結果

圖2 病例3 46,XY,t(2;14)(q33;q13)精子FISH 結果

圖3 病例6 46,XY,inv(4)(p14q33),t(6;14)(p21;q24) 精子FISH 結果

圖4 病例7 45,XY,der(13;14)(q10;q10) 精子FISH 結果

I 表示第一輪探針FISH 檢測，應用1 號染色體短臂亞端粒探針（Tel 1p，綠色信號）和1 號染色體長臂亞端粒探針（Tel 1q，紅色信號）組合檢測；II 表示第二輪探針FISH 檢測，應用3 號染色體短臂亞端粒探針（Tel 3p，綠色信號）進行檢測。同一個精子核中每個探針信號均1個時，判斷為正常信號，否則為異常信號。

討 論

染色體異常包括染色體數量異常和結構異常，染色體數目異常如21- 三體綜合征（47,XY,+21）、克氏綜合征（47,XXY）、超雄綜合征（47，XYY）等。染色體結構異常是染色體發生斷裂后重新連接的結果[3]，根據斷裂的部位、數目、受累染色體以及重連方式的不同，可分為易位（相互易位、羅氏易位）、倒位、Y 染色體微缺失和端粒長度異常等。

染色體平衡易位是最常見的一種染色體結構異常，主要有相互易位、羅伯遜易位、復雜易位等；其中相互易位在群體中的發生率約為1/1 000-1/500，不育人群中的發生率為0.6%，無精子或少精子癥男性的染色體平衡易位的發生率為1.4%，在反復自然流產的人群中高達6.2%[4-5]。相互易位攜帶者自身可無表型，但在減數分裂中易位染色體及其同源染色體互相配對發生遺傳物質的交換，最后分離進入子細胞[6]，其分離方式包括2:2 對位分離、2:2 鄰近-1 分離、2:2 鄰近-2 分離、3:1 分離和4:0 分離等5 種，理論上可形成18 種類型的配子，其中1 種正常,1 種為平衡型易位，其余16 種均具有某一條染色體的重復或缺失。羅氏易位攜帶者在進行重組分離時可形成6 種類型的配子，其中1 種正常,1 種為平衡易位，其他4 種均為重復或缺失的不平衡配子[7]。這些是導致胚胎發育延遲、自然流產、胚胎停止發育、新生兒死亡、胎兒畸形及智力低下等的主要原因[8-10]。本研究通過熒光信號將染色體平衡型精子與不平衡精子進行區分，5 例相互易位病例平衡型精子率分別為27.98% （61/218）、28.94% （101/349）、40.26% （213/529）、25.71%（54/210)和34.10%（148/434)，1 例復雜結構異常病例平衡型精子率為10.95%（23/210)，1 例羅氏易位病例平衡型精子率為85.77%（1 079/1 258)，可見實際觀察到的染色體平衡型精子比例均明顯高于理論值，相關研究亦得出相似的結論[11]。Flynn 等[12]報道：在生育方面，經歷多次流產的男性平衡易位攜帶者累積活產率可達64.3%。根據平衡易位（相互易位、羅伯遜易位）攜帶者配子分離規律形成的配子類型，推測其生育染色體正常或平衡易位后代的理論概率，并不能得到臨床數據的支持[11]。上述染色體異常的病例其正常和（或）平衡型精子所占比例遠遠高于根據分離模式推測的理論概率，推測其可能機制為攜帶者產生的不平衡精子在減數分裂的過程中導致精母細胞凋亡，或異常的精子在精子發生過程中被清除，其具體機制仍需進一步研究。

染色體平衡易位攜帶者可選擇自然受孕或通過輔助生殖技術幫助其妊娠，在孕中期行產前診斷來獲取后代是完全可行的，但一定要讓患者充分了解不同生育方式的優缺點以及需要承擔的風險，同時明確產前診斷的重要性，做到知情選擇。隨著細胞及分子遺傳學診斷技術的發展，目前平衡易位患者多建議通過胚胎植入前遺傳學檢測（PGT）技術在胚胎植入女方宮腔前排除異常的胚胎[13]，但無論是胚胎植入前遺傳學檢測(PGT)，還是產前診斷都只是在檢測的時間節點上提前，并不能實質性的提高正常胚胎和胎兒的形成。染色體平衡易位的男性如可通過選擇精子的方式，在精卵結合之前即選擇染色體正常的精子，那么獲得更高概率的良好妊娠結局便成為可能，但如何選擇染色體正常的精子亟待解決。

綜上，通過熒光原位雜交技術（FISH）檢測染色體結構異常患者的精子染色體, 可為生育指導提供初步的客觀依據。限于樣本數較少，需進一步擴充樣本量、染色體異常類型，深化精子全染色體組的檢測，在更廣的范圍為生育指導提供更充分的依據。