北蟲草水提物對小鼠酒精性胃損傷保護作用研究

王千慧 黃竹青 鄭劍玲 劉 穎 卜 桐 付趙軍 谷思文 張 帆 齊 賀

遼寧省基礎醫學研究所 遼寧醫藥職業學院(遼寧 沈陽 110101)

隨著經濟增長,我國酒精飲品消耗量顯著增加,如何消除過度飲酒所帶來的健康隱患和相關疾病已成為世界性問題。據統計,酗酒是導致疾病與殘疾的第三大危險因素之一,目前已證明有200余種疾病與過度飲酒相關[1]。酒精除了對肝臟、胰腺等造成損傷之外,還對胃腸道粘膜造成直接或間接的損害[2-3]。北蟲草(Cordyceps militaris),又稱為北冬蟲夏草,屬于子囊菌類的麥角菌目,麥角菌科,真菌屬[4]。北蟲草中富含腺苷、蟲草素、蟲草酸、小分子肽等多種活性物質,具有良好的調節免疫、抗氧化、抗腫瘤、抗感染等藥理學作用[5-7]。但其水提物對胃組織酒精損傷的保護作用卻鮮有研究,因此本文通過測定小鼠酒精胃損傷后胃組織中SOD,GST,ADH,ALDH活性變化和MDA含量變化,為拓展開發北蟲草相關產品提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 50只體重為18～22g昆明小鼠,雌雄各半分籠飼養,購自遼寧長生生物技術股份有限公司,實驗動物生產許可證號:SCXK(遼)2015- 0001。

1.2試劑與儀器設備 超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)活性檢測試劑盒、乙醇脫氫酶(ADH)活性檢測試劑盒、乙醛脫氫酶(ALDH)活性檢測試劑盒均購于北京索萊寶生物科技有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1 北蟲草水提物制備方法 本研究采用低、高溫提取相結合方法。低溫提取溫度為45℃,物料比1∶30,提取3h,然后采用4000rpm離心10min,分離得到上清液Ⅰ；對沉淀進行第二次高溫提取,設定溫度80℃,物料比1∶30,提取3.5h后采用4000rpm離心10min,得上清液Ⅱ,合并兩次上清液旋轉蒸發進行濃縮,最后將濃縮液凍干得到粉末,置于-20℃冰箱中保存備用。使用時,用純化水進行溶解,現用現配[8]。

1.3.2 造模及給藥方法 50只昆明小鼠,雌雄各半,體重:18～22g,隨機分成五組。空白對照組:常規飼料,飲食自由,每日上午用蒸餾水(10ml/kg)灌胃,3h后再次采用蒸餾水(0.1ml)灌胃；病理模型組:常規飼料,飲食自由,參考蔡琦、李楊等人的造模方法和預實驗情況,本課題組每日上午采用35%酒精(10ml/kg)灌胃,3h后采用蒸餾水(0.1ml)灌胃[9-10]；北蟲草低、中、高濃度給藥組:常規飼料,飲食自由,每日上午采用35%酒精(10 ml/kg)灌胃,3h后分別采用0.5g/kg、1.0g/kg和2.0g/kg北蟲草水提物進行灌胃,飼養14天,末次灌胃后禁食不禁水,24h后處死小鼠并立刻取出小鼠胃組織備用[8]。

1.3.3 指標測定 將各組胃組織按0.1g/1ml(組織/提取液)加入相應提取液,于冰浴下進行勻漿,然后將勻漿液置于超聲波細胞粉碎儀中,采用功率200w、超聲3s、間隔10s并重復超聲30次進行細胞破碎。按各試劑盒說明書要求分別離心獲取各組小鼠胃組織上清液,分別測定各組小鼠胃組織上清液中SOD,GST,ADH和ALDH活性及MDA含量。

1.4數據處理 本研究數據均采用SPSS 13.0進行分析,所得數據均用平均值±標準差表示,多樣本間均值差異采用t檢驗,以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1肉眼觀察對照組、病理模型組和高濃度給藥組小鼠胃組織病理變化 通過肉眼觀察對照組、病理模型組和高濃度給藥組小鼠胃組織可以發現:對照組小鼠胃內組織光滑、完整,褶皺正常,未出現充血點等病理情況,病理模型組小鼠則出現明顯的充血點,表明酒精對小鼠胃組織造成損傷,而高劑量給藥組小鼠胃組織中充血點明顯減少。

圖1 對照組、病理模型組和高濃度給藥組小鼠胃組織病理改變

2.2不同濃度北蟲草水提物對小鼠胃組織中SOD、MDA的影響 與對照組小鼠相比,病理模型組小鼠胃組織中SOD活性下降(242.61±35.60 vs 171.91±14.81,P<0.05)；與病理模型組相比,給藥組小鼠胃組織中SOD活性明顯增強,且存在濃度依賴性(171.91±14.81 vs 274.01±45.32,P<0.05;171.91±14.81 vs 297.99±44.98,P<0.01;171.91±14.81 vs 301.52±48.58,P<0.05)。與對照組小鼠相比,病理模型組小鼠胃組織中MDA含量明顯增高(5.05±0.78 vs 12.01±1.02,P<0.01)；北蟲草低劑量組小鼠其MDA含量與模型組小鼠相比無明顯差異,北蟲草中、高劑量組小鼠其MDA含量均明顯下降,且呈現濃度依賴性(12.01±1.02 vs 7.75±0.46,P<0.01;12.01±1.02 vs 5.13±0.39,P<0.01)。

圖2 各組小鼠胃組織中SOD活性#:與對照組相比,P<0.05;*:與模型組相比,P<0.05;**:與模型組相比,P<0.01

圖3 各組小鼠胃組織中MDA含量#:與對照組相比,P<0.05;##:與對照組相比,P<0.01;**:與模型組相比,P<0.01

2.3不同濃度北蟲草水提物對小鼠胃組織中GST的影響 GST在機體內能夠催化谷胱甘肽與多種有毒物質結合,在人體Ⅱ期解毒過程中發揮發揮著重要應用[11]。與對照組小鼠相比,病理模型組小鼠胃組織中GST活性明顯下降(3.52±0.68 vs 0.97±0.22,P<0.01)；與病理模型組小鼠相比,北蟲草水提物低、中、高劑量均使小鼠胃組織中GST活性升高(0.97±0.22 vs 1.70±0.27,P<0.05;0.97±0.22 vs 2.02±0.16,P<0.01;0.97±0.22 vs 3.42±0.46,P<0.01),且呈現明顯的濃度依賴性。

圖4 各組小鼠胃組織中GST活性#:與對照組相比,P<0.05;*:與模型組相比,P<0.05;**:與模型組相比,P<0.01

2.4不同濃度北蟲草水提物對小鼠胃組織中ADH和ALDH的影響 與對照組小鼠相比,病理模型組小鼠胃組織中ADH與ALDH活性均略有升高(0.44±0.03 vs 0.49±0.01,P<0.05;106.67±13.33 vs 167.33±22.37,P<0.05)；與病理模型組小鼠相比,北蟲草中、高劑量組小鼠胃組織中ADH活性明顯增強(0.49±0.01 vs 0.81±0.09,P<0.01;0.49±0.01 vs 0.74±0.11,P<0.01),低劑量組無明顯變化；同時與病理模型組小鼠相比,給藥組小鼠胃組織中ALDH活性均升高,且存在濃度依賴性(167.33±22.37 vs 196.33±19.77,P<0.05;167.33±22.37 vs 252.67±41.84,P<0.05;167.33±22.37 vs 262.33±37.85,P<0.01)。

圖5 各組小鼠胃組織中ADH活性#:與對照組相比,P<0.05;*:與模型組相比,P<0.05;**:與模型組相比,P<0.01

圖6 各組小鼠胃組織中ALDH活性變化#:與對照組相比,P<0.05;*:與模型組相比,P<0.05;**:與模型組相比,P<0.01

3 討論

SOD是機體抗氧化系統中最重要的酶類之一。生理條件下,胃腸道本身會產生并釋放少量氧自由基,上皮細胞中的NADPH等氧化酶也會產生氧自由基和H2O2,此時機體依靠SOD等重要的抗氧化損傷防御系統及時清除體內的氧自由基,防止其達到組織損傷水平,而MDA正是這些自由基脂質過氧化的最終產物,且MDA可導致細胞內蛋白質、核酸等生物學大分子發生交聯,產生細胞毒性。因此SOD和MDA被公認為能較好反映機體內自由基變化和氧化損傷的兩個重要指標。目前大量meta分析表明酒精可以引起胃黏膜損傷、胃潰瘍、胃癌及肝硬化等疾病的發生[12-14],同時最新的研究表明活性氧是乙醇引起黏膜損傷的重要因素之一[13,15-16]。因此,氧化應激損傷是導致以上疾病的關鍵環節[17]。同時還有研究發現乙醇可以抑制機體抗氧化酶和其他細胞保護蛋白的表達,包括超SOD-1和過氧化還原酶,從而加速ROS的生成[18]。本研究發現給予酒精后小鼠胃組織中SOD活性下降,且MDA含量明顯增高,表明酒精對小鼠胃組織已經造成氧化損傷,而北蟲草水提物可以提高小鼠酒精損傷后胃組織中SOD活性,并降低MDA含量,且存在明顯濃度依賴性,表明北蟲草具有良好的抗氧化能力,可以有效降低氧自由基對機體造成的損傷,起到抗氧化損傷作用。

GST是一類具有多種生理功能的蛋白質家族,主要催化各種親電性化合物與GSH巰基發生共價結合,因此GST在許多外源性、內源性化合物的解毒和代謝中起著重要作用[19-21]。據報道,酒精引起胃組織嚴重氧化應激過程中,除MDA含量增加外還降低胃谷胱甘肽含量來刺激脂質過氧化[22-24],因此提高GST活性對乙醇導致的胃損傷保護作用至關重要。本研究中發現:與對照組小鼠相比,病理模型組小鼠胃組織中GST活性明顯下降,表明短期、高劑量飲酒可使其清除體內有毒物質的能力下降,進而加重胃損傷；而給予北蟲草提取物后,其GST活性明顯升高,且存在濃度依賴性,表明北蟲草可以通過提高GST活性降低乙醇對胃組織的毒性作用。

乙醇脫氫酶(ADH)是機體內乙醇代謝最為重要的酶類之一,可將乙醇氧化成乙醛,主要分布于肝臟組織中。Pestalozzi等人發現ADH也存在于胃腸道中,這表明酒精在進入循環系統前先經過消化系統代謝,此現象被稱為乙醇的首過代謝(First pass metabolism,FPM)[25],而Jelski W等人研究發現FPM主要發生在胃組織中[26]。王國祥等人發現長時間攝入乙醇會導致胃腸道組織中ADH 活性下降,因此提高機體胃組織中ADH活性可以減少機體對乙醇的生物利用度,緩解乙醇對肝臟、腦組織等重要組織器官的毒害作用[27]。本研究發現與對照組小鼠相比,病理模型組小鼠其胃組織中ADH活性略有升高,表明短期、高劑量飲酒可以刺激小鼠胃組織,使其ADH活性增強；同時在給予北蟲草水提物后,進一步增強給藥組小鼠胃組織中ADH活性,表明北蟲草水提物可以增強乙醇的代謝,減輕肝臟代謝負荷,降低乙醇對肝、腦等重要組織的損傷。

乙醇經ADH或其他酶類體系氧化成乙醛,乙醛經過乙醛脫氫酶(ALDH)進一步氧化后成乙酸鹽,且乙醛已被國際癌癥研究機構(IARC)列為人類一類致癌物質,因此,乙醇代謝相關酶類的缺乏或功能失活,尤其是ADH和ALDH,可能會直接影響其致癌作用[28]。國外學者Nagayoshi等人發現,乙醇可以導致ALDH-2基因敲除小鼠胃組織DNA損傷,表明ALDH缺乏可能加速胃癌發生[29]。因此胃組織中ALDH活性對乙醛導致的消化道損傷起到至關重要的作用。本研究發現給予酒精后小鼠胃組織中ALDH 活性增強,且給藥組ALDH活性也有所上升,表明北蟲草可以提高胃組織中ALDH的活性,加速乙醇代謝中間產物乙醛的代謝,降低乙醇對消化道細胞的毒性損傷作用,減輕胃組織損傷,其作用機制可能與防止DNA損傷及降低炎癥反應有關[28]。因此,北蟲草提取物可以通過增強胃組織ADH、ALDH 活性,加速乙醇的代謝過程,降低中間代謝產物產生的消化道細胞毒性作用,降低乙醇對肝的毒性作用及負荷。

各組小鼠胃組織病理變化情況發現,高濃度給藥組小鼠胃組織損傷情況較模型組小鼠有明顯改善；此外實驗過程中,病理模型組小鼠在飼養至7～10天時,其進食、進水量明顯低于給藥組和對照組小鼠,進一步表明北蟲草水提物對小鼠胃組織具有一定的保護作用,與上述檢測結果相吻合。

綜上,北蟲草水提物可以提高小鼠酒精性胃損傷模型其胃組織中SOD、GST、ADH、ALDH活性,同時降低MDA含量,且存在一定的濃度依賴性,表明北蟲草水提物在降低氧化應激損傷、增強乙醇代謝等方面起到關鍵作用；同時本研究中采用了宋靜靜等人的研究成果進行北蟲草水提物制備,其水提物中含有豐富的蟲草多糖、蟲草酸、腺苷和蟲草素[8],表明這些活性物質很有可能參與到上述調節機制中,為北蟲草活性物質的研究及酒精性胃損傷的預防與治療提供實驗依據,為開發北蟲草相關產品奠定基礎。