紅脊長蝽感覺神經(jīng)元膜蛋白基因克隆及組織表達譜分析

宋月芹，白小軍，陳慶霄，呂琪卉，孫會忠*

(1.河南科技大學林學院，河南 洛陽 471000；2.宜陽縣林業(yè)技術指導站，河南 洛陽 471600)

昆蟲的化學感受系統(tǒng)在其生存和繁殖過程中起著極其重要的作用[1-3]。在過去10 多年的時間里，研究者對昆蟲觸角嗅覺信號傳導的分子機制研究有了突出的進步。在昆蟲嗅覺識別時，氣味分子從觸角感器孔滲入，然后被氣味結合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）或化學感受蛋白（chemosensory proteins，CSPs）識別和轉(zhuǎn)移，最后激活位于嗅覺感覺神經(jīng)元（olfactory sensory neurons，OSNs）樹突膜上的嗅覺受體（odorant receptors，ORs）或離子型受體（ionotropic receptors，IRs），產(chǎn)生電位，指導昆蟲做出相應的行為反應[4-8]。此外，還有一些蛋白如感覺神經(jīng)元膜蛋白（sensory neuron membrane proteins，SNMPs）在昆蟲氣味識別過程中也扮演著至關重要的作用[5]。

昆蟲SNMPs 也是一種膜蛋白，與脊椎動物CD36 家族為同源基因，具有2 個跨膜區(qū)域，其功能主要是識別和轉(zhuǎn)運親脂性氣味分子如脂肪酸和脂類化合物等[9-14]。昆蟲第一個SNMP 基因在多音天蠶（Antheraea polyphemusCramer）中被鑒定，并命名為ApolSNMP1[9]。隨后在煙草天蛾（Manduca sextaL.）中發(fā)現(xiàn)SNMP 的第二個亞類型，即命名為MsexSNMP2[10,15]。緊接著SNMP 的同源基因在鱗翅目Lepidoptera[10,15-16]、雙翅目Diptera[17]、鞘翅目Coleoptera[18]、直翅目Orthoptera[13]和膜翅目Hymenoptera[19]等昆蟲中都有發(fā)現(xiàn)。一直以來被認為SNMP 基因家族就2 個成員，即SNMP1 和SNMP2。最近昆蟲SNMP 家族的第三個成員SNMP3 在鱗翅目中被鑒定[20-21]，但認為該基因的主要功能與昆蟲的免疫反應有關，這還需要進一步的去證明。

紅脊長蝽（Tropidothorax elegansDistant）屬半翅目（Hemiptera）長蝽科（Lygaeidae），主要為害刺槐（Robinia pseudoacaciaL.）、辣椒（Capsicum annuumL.）、葫蘆（Lagenaria sicerariaMolina）、油菜（Brassica napusL.）、大白菜（Brassica pekinensisLour.）和小麥（Triticum aestivumL.）等多種植物，食性較雜。關于紅脊長蝽的嗅覺基因研究較少，本研究通過前期紅脊長蝽觸角轉(zhuǎn)錄組測序結果[22]，鑒定了紅脊長蝽的2 個SNMP 基因，即TeleSNMP1和TeleSNMP2，并通過熒光定量PCR 技術對紅脊長蝽TeleSNMP1和TeleSNMP2在不同組織中的表達情況進行分析，為進一步探索紅脊長蝽SNMPs 的化學通訊功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試蟲的準備

紅脊長蝽來自河南科技大學林學院昆蟲實驗室，該群體為自2014 年7 月在洛陽周邊（112?26′ E，34?43′ N）蔬菜地采集的成蟲，然后在溫室內(nèi)繼代飼養(yǎng)至今。溫室條件為：溫度25 ± 2℃，相對濕度60% ± 5%，光周期14L∶10D。

1.2 總RNA 的提取與第一鏈cDNA 的合成

選取紅脊長蝽羽化后第3 d 的雌雄成蟲，收集觸角各100 頭、頭部各30 頭、胸部各20 頭、腹部各5 頭、足各50 頭、翅各50 頭，每個樣品收集材料重復3 次。將紅脊長蝽各部分組織解剖后立即放入浸在液氮中的1.5 mL 離心管內(nèi)，然后保存于?80℃中。

總RNA 的提取采用RNAiso Plus Kit（TaKaRa，北京）試劑盒進行，并使用RNase-free DNase I（TaKaRa，北京）對提取的RNA 進行除DNA 處理。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000c 分光光度計（Thermo Scientific）進行質(zhì)量檢測。采 用PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，北京）試劑盒對RNA 進行反轉(zhuǎn)錄。

1.3 紅脊長蝽SNMPs 基因的克隆

從本實驗室前期對紅脊長蝽觸角轉(zhuǎn)錄組測序注釋結果中[21]搜素到2 個SNMP 基因。根據(jù)該序列設計特異性引物，TeleSNMP1-F：5′-ATGGCTG CACCACTGAGG-3′，TeleSNMP1-R：5′-CTAGTA CTTTGCCGGGGGTG-3′；TeleSNMP2-F：5′-ATG ACGAAGGTGCTGTTCCC-3′，TeleSNMP2-R：5′-T TAGCTTGTGAGAGTCCTTTTGA-3′，進行PCR 擴增。PCR 反應體系為20 μL：雌蛾觸角cDNA 模板1 μL，上下游引物各1.5 μL（10 μmol·L?1），dNTPs混合液1.6 μL（2.5 μmol·L?1），Ex Taq DNA 聚合酶0.2 μL（TaKaRa，大連），10×Ex Taq buffer 2 μL，ddH2O 為12.2 μL。PCR 反應條件為：94℃5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個循環(huán)；最后72℃ 10 min。膠回收目的片段，將目的片段克隆到pMDTM19-T 載體上，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆培養(yǎng)過夜，送去測序。

1.4 紅脊長蝽SNMPs 基因的序列分析

核酸序列采用在線工具（http://www.bio-soft.net/sms/）翻譯；采用（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）在線工具進行跨膜區(qū)域預測；利用在線工具（https://web.expasy.org/protparam/）對蛋白序列特性進行分析；蛋白親疏水性采用在線工具（https://web.expasy.org/protscale/）分析；序列比對采用線下DNAMAN 進行多重序列比較；進化樹采用線下MEGA 6.0 構建。

1.5 實時定量PCR

通過熒光定量PCR 檢測紅脊長蝽SNMPs 基因在不同組織中的表達情況。根據(jù)紅脊長蝽SNMPs基因的開放閱讀框和熒光定量引物設計原則設計特異性引物，TeleSNMP1-F：TCACCATCCCTCATC CA，TeleSNMP1-R：TCTTCGCCGTCTTTCAT，Tele SNMP2-F：TGTGGGAACGGAACTCT，TeleSNMP2-R：GCACCTTGGCACTTTG。內(nèi)參基因為紅脊長蝽Actin 基因（基因登陸號為MG322127），引物為：TeleActin-F：CAAGGACGAAACAATCA；TeleActin-R：GAGAATACACTCCCAGAAC。

熒光定量PCR被執(zhí)行在ABI 7500 PCR 儀（ABI，Carlsbad，CA，USA）上進行，每個反應體積20 μL，包括10 μL 的2×SYBR Green PCR Master Mix（TaKaRa，大連）、0.8 μL 的正反向引物（10 μmol·L?1）、2 μL 的cDNA 模板（200 ng）和6.4 μL 的DEPC 水。PCR 循環(huán)遵循95℃ 30 s，然后95℃ 5 s，53℃ 31 s，共循環(huán)40 個周期。試驗重復3 次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

紅脊長蝽SNMPs 基因在不同組織中的相對表達量采用公式2???CT[23]計算。利用SPSS 17.0 軟件中的ANOVA 方法對TeleSNMPs 在紅脊長蝽不同組織中的表達量進行顯著性差異比較（新復極差法檢驗，P≤ 0.05）。

2 結果與分析

2.1 紅脊長蝽SNMPs 基因克隆及序列分析

將測序結果在NCBI 上進行同源性搜索，結果表明所測序列與多種昆蟲的SNMP 基因序列高度同源，證明這2 個基因就是紅脊長蝽的SNMP 基因，并分別命名為TeleSNMP1和TeleSNMP2，在NCBI基因登陸號分別為MW442946 和MW442947。

這2 個SNMPs 基因都具有全長的開放閱讀框，TeleSNMP1長度為1 497 bp，編碼498 個氨基酸（圖1）；而TeleSNMP2長度為1 686 bp，編碼561 個氨基酸。這2 個基因都是酸性，TeleSNMP1的等電點是8.26，蛋白分子量是55.59 kD；TeleSNMP2的等電點是7.05，蛋白分子量是63.37 kD。

TeleSNMP1和TeleSNMP2在氨基酸序列的N-端和C-端各有一個跨膜區(qū)域，其中TeleSNMP2在氨基酸第158 和180 之間還有一個跨膜區(qū)域。在膜外區(qū)域6 個保守的半胱氨酸殘基位點被預測（圖1），這6 個保守的半胱氨酸位點與CD36 基因家族相似。

圖1 紅脊長蝽TeleSNMP1 和TeleSNMP2 與其他昆蟲SNMPs 的序列比對Fig.1 Alignment of Tropidothorax elegans SNMP1 and SNMP2 with SNMPs from other insects

2.2 紅脊長蝽SNMPs 與其他昆蟲SNMP 基因的同源性及進化樹分析

將紅脊長蝽TeleSNMP 基因與已報道的其他昆蟲SNMP 基因的氨基酸序列在NCBI 中的Blastp在線搜索工具進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)TeleSNMP 基因與不同種類昆蟲SNMP 基因一致性差別較大。與同目昆蟲SNMP 基因一致性較高，如TeleSNMP1與茶翅蝽 (Halyomorpha halysStal)HhalSNMP1序列一致性在81.33%；與苜蓿盲蝽 (Adelphocoris lineolatusGoeze)AlinSNMP1序列一致性在68.54%；與不同目昆蟲SNMP 基因一致性較低，如TeleSNMP1與斑痣懸繭蜂 (Meteorus pulchricornisWesmael)MpulSNMP1序列一致性在43.44%。但TeleSNMP2與所有昆蟲SNMP 基因一致性都不高，如與茶翅蝽HhalSNMP2序列一致性在48.68%；與苜蓿盲蝽AlinSNMP2序列一致性在41.18%；與德國小蠊 (Blattella germanicaLinnaeus)BgerSNMP1序列一致性在46.22%。TeleSNMP2與玉帶鳳蝶 (Papilio polytesL.)PpolSNMP2序列一致性在30.94%；與亞洲小車蝗 (Oedaleus asiaticusBei-Bienko)OasiSNMP2序列一致性在34.76%。紅脊長蝽TeleSNMP1和TeleSNMP2之間序列一致性僅有29.66%。

使用MEGA6.0 對9 個目的36 種昆蟲SNMP同源基因進行進化樹比較。SNMPs 基因被分成2 個亞組，即SNMP1 和SNMP2（圖2），每亞組中同目昆蟲SNMP 基因同源性最高。紅脊長蝽的TeleSNMP1和TeleSNMP2基因分別被集聚到這2 個亞組，并且與同為半翅目昆蟲的苜蓿盲蝽、茶翅蝽和黑肩綠盲蝽SNMP 基因進化關系最近，與其他目昆蟲SNMP 關系較遠。

圖2 紅脊長蝽SNMPs 與其他昆蟲SNMPs 氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the SNMPs of Tropidothorax elegans and other insects based on amino acid sequences by using neighbor-joining method

2.3 紅脊長蝽SNMPs 基因表達譜分析

使用熒光定量PCR 對紅脊長蝽TeleSNMP1和TeleSNMP2在不同組織中的表達情況進行分析，結果發(fā)現(xiàn)：TeleSNMP1和TeleSNMP2在雌雄蛾觸角中高度表達，TeleSNMP1在雄蛾觸角中的表達量明顯高于雌蛾，TeleSNMP2的表達情況剛好相反，即TeleSNMP2在雌蛾觸角中的表達量明顯高于雄蛾。除觸角外，TeleSNMP1幾乎不在其他組織中表達或表達量甚微。TeleSNMP2除在觸角中表達量豐富外，在足和翅中也有少量表達（圖3）。

圖3 紅脊長蝽SNMPs 在不同組織中的相對表達量Fig.3 Expression level of SNMPs in different tissues of Tropidothorax elegans

3 討論

本研究根據(jù)前期紅脊長蝽觸角轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，通過BLASTX 在線搜索和同源性比較鑒定出2 個SNMPs 基因，即TeleSNMP1和TeleSNMP2。這2 個基因與其他昆蟲SNMPs 具有類似的特征，如在氨基酸序列N 端和C 端附近有2 個保守的跨膜區(qū)域，并且由6 個保守的半胱氨酸殘基形成二硫鍵組成一個大的胞外環(huán)，此結構也與CD36 基因家族極其相似[24-26]。根據(jù)對這2 個跨膜蛋白結構投影預測，這部分的功能是轉(zhuǎn)運和結合脂類分子[27-28]，我們可推測紅脊長蝽SNMPs 的2 個跨膜區(qū)具有同樣的功能。但紅脊長蝽TeleSNMP2在氨基酸序列第158 和180 之間多了1 個跨膜區(qū)域，目前關于SNMPs 基因具有3 個跨膜區(qū)域的報道還沒有，可能是鑒定的SNMPs 數(shù)量還不夠龐大，也可能長期進化形成的。

紅脊長蝽TeleSNMP 基因同源性搜索發(fā)現(xiàn)TeleSNMP 基因與不同種類昆蟲SNMP 基因一致性差別較大。與同目昆蟲SNMP 基因一致性較高，與不同目昆蟲SNMP 基因一致性較低。紅脊長蝽TeleSNMP1和TeleSNMP2之間分歧也比較大。進化樹結果也顯示，紅脊長蝽TeleSNMP1和TeleSNMP2分別被集聚到SNMP1 和SNMP2 兩個亞組，在同一組內(nèi)同目昆蟲的SNMP 基因進化關系最近，與其他目昆蟲SNMP 關系較遠。此結果與大多數(shù)昆蟲SNMP 基因特性相同[26,29-30]。在鱗翅目中曾經(jīng)鑒定出SNMP3 亞家族基因[20]，而在紅脊長蝽觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中沒有發(fā)現(xiàn)該基因，可能是這個基因在幼蟲腸中高度表達的原因。

組織特異性表達可以為功能預測提供可靠性的參考。我們研究發(fā)現(xiàn)紅脊長蝽SNMP1主要表達在雌雄蛾的觸角中，此結果與多音蠶蛾[9]、臍橙螟（Amyelois transitellaWalker）[31]、甜 菜夜蛾（Spodoptera exiguaHtibner）[32]和中紅側(cè)溝繭蜂（Microplitis mediatorHaliday）[33]等多種昆蟲SNMP1的表達模式相同。Benton 等[34]在果腹黑蠅（Drosophila melanogasterwDm）中發(fā)現(xiàn)，DmelSNMP1能夠識別集合信息素cVA，激活受體HR13。Pregitzer 等[28]在煙芽夜蛾（Heliothis virescensFabricius）中也發(fā)現(xiàn)，HvirSNMP1 能明顯增強HR13 對信息素Z11-16:Ald 的結合力。以上研究都暗示昆蟲SNMP1 的功能是調(diào)節(jié)信息素的識別和通過SNMP-OR 互作轉(zhuǎn)運信息素。相對于TeleSNMP1，TeleSNMP2的表達相對廣泛，除嗅覺感器觸角外，在非嗅覺感器足中也有少量表達，此結果與小菜蛾（Plutella xylostellaL.）[35]、二化螟（Chilo suppressalisWalker）[36]、稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalisG.）[37]、甜菜夜蛾[31]和中紅側(cè)溝繭蜂[32]一致。昆蟲身體上分布有大量的味覺感器[38]，而CD36 蛋白的主要功能是轉(zhuǎn)運脂類化合物，因此可推測TeleSNMP2和GRs 在這些組織中共同表達，識別脂類分子完成味覺過程。

4 結論

本研究首次克隆和鑒定了紅脊長蝽的2 個SNMPs 基因，即TeleSNMP1和TeleSNMP2。同目昆蟲同類SNMP 同源序列一致性較高，反之，不同目昆蟲不同類SNMP 同源序列一致性較低。同樣，TeleSNMP1和TeleSNMP2之間的序列一致性也極低。TeleSNMP1主要在雌雄觸角中特異性表達，而TeleSNMP2除觸角外，在非觸角組織中也有表達。