三七總皂苷和燈盞花素單用與聯(lián)用時(shí)主要成分的藥動(dòng)學(xué)比較

孫韜華，閆泰山，黎維勇，陳安進(jìn)

(1.青島市市立醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)研究科，青島 266011；2.青島市市立醫(yī)院藥學(xué)部，青島 266011；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，武漢 430022)

三七總皂苷為五加科植物三七的主根或根莖經(jīng)加工制成的總皂苷，2015年版《中華人民共和國藥典》中，以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd進(jìn)行三七總皂苷的鑒定和含量測定[1]。三七總皂苷的制劑在臨床上應(yīng)用廣泛，其中三七總皂苷粉針可用于瘀血阻絡(luò)、卒中偏癱等癥。燈盞花素是從菊科植物短葶飛蓬中提取分離所得干燥粉末，其主要有效成分為野黃芩苷[1]，燈盞花素粉針在臨床上用于卒中及其后遺癥等的治療。從適應(yīng)證來看，三七總皂苷粉針和燈盞花素粉針具有相近之處。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，三七總皂苷和燈盞花素聯(lián)合應(yīng)用，具有改善急性心肌缺血[2]、急性腦缺血癥狀[3]等功效，可以顯著降低腦梗死大鼠血清中誘導(dǎo)一氧化氮合酶的活力及總一氧化氮合酶的含量，與單藥組相比有明顯差別[4]。這一結(jié)果提示可對(duì)兩者聯(lián)合用藥進(jìn)行進(jìn)一步研發(fā)。本實(shí)驗(yàn)中，考察了二者制成的復(fù)方粉針(下文中簡稱為：復(fù)方粉針)在健康比格犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，并與單方制劑三七總皂苷粉針和燈盞花素粉針進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 比格犬30只，雌、雄各半，體質(zhì)量(10.83±0.68) kg，安陸瑞克森實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2008-0001。使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2010-0057。飼養(yǎng)于普通級(jí)環(huán)境，室溫18～29 ℃，相對(duì)濕度30%～75%，室內(nèi)光照明暗交替各12 h，單籠飼養(yǎng)，普通飼料投喂，自由飲用凈化水。

1.2藥品與試劑 三七皂苷R1(含量98.0%，批號(hào)：110745-200617)、人參皂苷Rg1(含量96.3%，批號(hào)：110703-201027)、人參皂苷Re(含量88.8%，批號(hào)：110754-200822)、人參皂苷Rb1(含量92.6%，批號(hào)：110704-200921)、人參皂苷Rd(含量94.4%，批號(hào)：111818-201001)、野黃芩苷(含量96.4%，批號(hào)：110842-200102)及內(nèi)標(biāo)替米沙坦(含量99.3%，批號(hào)：100629-200401)對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院。復(fù)方粉針(規(guī)格：每支含三七總皂苷125 mg，野黃芩苷5 mg，批號(hào)：20120816)、三七總皂苷粉針(規(guī)格：三七總皂苷125 mg/支，批號(hào)：20121023)、燈盞花素粉針(規(guī)格：野黃芩苷5 mg/支，批號(hào)：20121101)均由麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司研制。色譜純甲醇、乙腈購自德國Merck公司；色譜純乙酸銨購自廣州迪馬公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3儀器與設(shè)備 LC-30AD型液相色譜系統(tǒng)，QTRAN 5500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；梅特勒AB-265S型精密天平(感量：0.01 mg)；XW-80A微型渦旋混合儀；Thermo BR4i型高速離心機(jī)；ANNEL DC-12氮吹儀；UNT優(yōu)普超純水機(jī)。

1.4動(dòng)物分組、給藥和血樣采集 30只健康比格犬采用SAS9.4編寫隨機(jī)程序，按照1：1：1隨機(jī)分成復(fù)方粉針組、三七總皂苷粉針組和燈盞花素粉針組，分別靜脈注射復(fù)方粉針8.67 mg·kg-1，三七總皂苷注射液8.33 mg·kg-1，燈盞花素注射液0.33 mg·kg-1。復(fù)方粉針及三七總皂苷粉針組：于給藥前及給藥結(jié)束后2，5，10，15，20，30，40，50 min，1，1.5，2，2.5，3，4，5，6，8，12，24，36，48，72，96，120，168 h采血；燈盞花素粉針組：給藥前及給藥后2，5，10，15，20，30，40，50 min，1，1.5，2，2.5，3，4，5，6，8 h采血。血樣置于肝素抗凝試管中，采血后立即4 ℃，3000 r·min-1離心10 min(r=17 cm)，取上清液于-80 ℃保存待測。

1.5色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件 Ultimate Polar-C18色譜柱(2.1 mm ×100 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-20 mmol·L-1乙酸胺溶液(B)，梯度洗脫，洗脫程序詳見表1。流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；樣品箱溫度：4 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

表1 6種組分的洗脫程序 Tab.1 Elution program for six components

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源，負(fù)離子模式，多反應(yīng)離子監(jiān)測；離子源電壓為-4500 V，溫度為600 ℃，監(jiān)測離子對(duì)分別為：三七皂苷R1m/z931.60→475.40，人參皂苷Rg1m/z799.50→637.50，人參皂苷Rem/z945.60→475.50，人參皂苷Rb1m/z1107.70→945.60，人參皂苷Rdm/z945.60→621.50，野黃芩苷m/z461.10→285.10，替米沙坦m/z513.30→469.30。

1.6血漿樣品的處理 取血樣0.2 mL，加入亞硫酸氫鈉(1 mol·L-1)和內(nèi)標(biāo)工作液(替米沙坦1.15 μg· mL-1)各30 μL，加入甲醇0.6 mL；渦旋1 min后，15 000 r·min-1離心10 min(r=8.4 cm)，取上清液5 μL進(jìn)樣分析。

1.7標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 對(duì)照品溶液的配制：精密稱取各對(duì)照品適量，用甲醇溶解定容，制成的儲(chǔ)備液濃度分別為三七皂苷R1239.32 μg· mL-1，人參皂苷Rg1235.16 μg· mL-1，人參皂苷Re 197.49 μg· mL-1，人參皂苷Rb1244.65 μg· mL-1，人參皂苷Rd 1.247 mg· mL-1，野黃芩苷214.59 μg· mL-1。分別取上述6 種成分的對(duì)照品儲(chǔ)備液3.34，5.74，1.52，8.17，7.21，4.66 mL，分別用甲醇定容至10 mL，再經(jīng)甲醇系列稀釋7個(gè)梯度，得線性范圍項(xiàng)下各對(duì)照品溶液濃度。

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精密稱取替米沙坦對(duì)照品(含替米沙坦11.43 mg)11.51 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到228.6 μg· mL-1替米沙坦儲(chǔ)備液，置于-20 ℃冰箱保存。用甲醇將替米沙坦儲(chǔ)備液稀釋至1150 ng· mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液備用。

1.8質(zhì)量控制樣品的配制 取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、野黃芩苷的低、中、高濃度質(zhì)量控制溶液各20 μL，混勻后氮?dú)獯蹈桑尤肟瞻兹獫{200 μL，配制各濃度質(zhì)量控制樣品。各組分質(zhì)量控制樣品的濃度詳見表2。

表2 6種組分的質(zhì)量控制樣品濃度 Tab.2 Concentration of quality control for six components ng· mL-1

2 結(jié)果

2.1特異性 在本實(shí)驗(yàn)條件下，各色譜峰峰形良好，分離完全。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、野黃芩苷和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別約為2.73，3.56，3.54，3.91，4.75，2.21和4.36 min。見圖1。

A.三七皂苷R1；B.人參皂苷Rg1；C.人參皂苷Re；D.人參皂苷Rb1；E.人參皂苷Rd；F.野黃芩苷；G.替米沙坦。圖1 復(fù)方粉針給藥10 min后比格犬血樣色譜圖 A.notoginsenoside R1；B.ginsenoside Rg1；C.ginsenoside Re；D.ginsenoside Rb1；E.ginsenoside Rd；F.scutellarin；G.telmisartan.Fig.1 Chromatogram of plasma sample from Beagles 10 min after the administration of compound injection

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線 取三七總皂苷各組分及野黃芩苷各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μL，混勻后氮?dú)獯蹈桑尤肟瞻兹獫{200 μL，配制成各濃度模擬血漿樣品，按照“1.6”項(xiàng)下操作，以待測物濃度為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(W=1/X2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明血漿中以上6種成分線性關(guān)系良好。各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍及典型線性方程見表3。

表3 6種組分的典型方程和線性范圍 Tab.3 Linear equation and linear range for six components

2.3準(zhǔn)確度、精密度 質(zhì)量控制按照“1.6”項(xiàng)下操作，每一濃度進(jìn)行5份樣本分析，連續(xù)測定3 d，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算質(zhì)量控制樣品的測得濃度，根據(jù)質(zhì)量控制樣品結(jié)果計(jì)算準(zhǔn)確度與精密度。經(jīng)測定3個(gè)濃度下三七皂苷R1等6種組分的日內(nèi)和日間精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)最大值為10.07%，低、中、高濃度下各檢測成分質(zhì)量控制的準(zhǔn)確度相對(duì)誤差(RE)最大值為-8.03%。結(jié)果見表4。

2.4提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 質(zhì)量控制按照“1.6”項(xiàng)下操作，每一濃度進(jìn)行5份樣本分析，獲得相應(yīng)峰面積(A1)；于EP管中加入各組分低、中、高濃度質(zhì)量控制溶液20 μL以及內(nèi)標(biāo)溶液(1150 ng· mL-1) 30 μL，混勻后氮?dú)獯蹈桑煌瑫r(shí)取5份不同來源空白犬血漿200 μL，除不加質(zhì)量控制溶液和內(nèi)標(biāo)溶液外，按“1.6”項(xiàng)下操作，然后盡取上清液，加入到前述EP管內(nèi)，取上清液進(jìn)樣分析，獲得相應(yīng)峰面積(B1)；取各組分低、中、高濃度質(zhì)量控制溶液各20 μL以及內(nèi)標(biāo)溶液30 μL，混勻后氮?dú)獯蹈桑尤爰兓?00 μL，加入甲醇0.6 mL；渦旋1 min后，15 000 r·min-1離心10 min(r=8.4 cm)，取上清液進(jìn)樣分析。獲得相應(yīng)峰面積(C1)。以A1/B1計(jì)算提取回收率，以B1/C1計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，在低、中、高濃度下，各組分提取回收率穩(wěn)定；血漿基質(zhì)對(duì)各組分的測定無影響。結(jié)果見表4。

2.5穩(wěn)定性 考察各組分低、中、高濃度質(zhì)量控制的室溫(室溫放置2 h)，處理后4 ℃放置2 h，凍融(凍融循環(huán)3次)及長期穩(wěn)定性(-80 ℃冷凍下放置54 d)。經(jīng)測定，4種情況下得到的6種組分的峰面積與零時(shí)間點(diǎn)的偏差均在15%以內(nèi)，提示實(shí)驗(yàn)條件下血漿樣品穩(wěn)定性良好。結(jié)果詳見表4。

表4 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果 Tab.4 Validation results of the methodology %，n=5

2.6藥動(dòng)學(xué)結(jié)果 以DAS 2.1.1版軟件計(jì)算相關(guān)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，復(fù)方粉針組、三七總皂苷粉針組及燈盞花粉針組各組分的相關(guān)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果見表5。其中除血漿消除半衰期(t1/2)、濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC0-∞)外，達(dá)峰時(shí)間(tmax)、峰濃度(Cmax)為實(shí)測值。復(fù)方粉針組與三七總皂苷粉針組中多種組分Cmax差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，包括三七皂苷R1(P<0.05)，人參皂苷Rg1(P<0.01)，人參皂苷Re(P<0.01)和人參皂苷Rd(P<0.01)。

表5 復(fù)方粉針、三七總皂苷粉針、燈盞花素粉針各組分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) Tab.5 Pharmacokinetic parameters of each component in compound injection，notoginseng total saponins for injection and breviscapine for injection

3 討論

筆者建立了檢測三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb、人參皂苷Rd、野黃芩苷在比格犬血漿中濃度的液質(zhì)聯(lián)用方法。該方法專屬性好，檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二醇型皂苷(人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd)和三醇型皂苷(三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re)在比格犬內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)差異較大：三醇型皂苷的血藥濃度從2 min的峰濃度迅速下降，呈快速的分布及消除特征；二醇型皂苷的血藥濃度下降緩慢，其t1/2遠(yuǎn)大于三醇型皂苷，表明二醇型在血中分布較慢，在體內(nèi)滯留時(shí)間長，可能與人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd的血漿蛋白結(jié)合率較高有關(guān)[5]。野黃芩苷的血藥濃度呈快速下降趨勢，在體內(nèi)快速分布，消除較快，靜脈注射給藥后2 h血漿濃度已低于10 ng· mL-1，表明野黃芩苷在比格犬體內(nèi)滯留時(shí)間較短。

復(fù)方粉針與三七總皂苷粉針或燈盞花素粉針單用相比，人參皂苷Rb1和野黃芩苷的峰濃度Cmax未見顯著性差異，但三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd的Cmax顯著性升高。三七總皂苷粉針和燈盞花素粉針及復(fù)方粉針單次給藥的血藥濃度-時(shí)間曲線相似，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)包括t1/2、AUC0-∞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明兩者聯(lián)合用藥可提高三七總皂苷部分組分的Cmax，但對(duì)野黃芩苷的藥動(dòng)學(xué)沒有明顯影響。

三七總皂苷具有顯著緩解腦缺血再灌注損傷的作用，其機(jī)制可能與降低血清一氧化氮含量[6]、改善腦組織血流供應(yīng)[7]等有關(guān)；燈盞花素注射液對(duì)急性缺血再灌注腦損傷亦具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能涉及改善腦血流量和減少腦組織中n6多不飽脂肪酸的含量等[8]。兩者作用機(jī)制上是否會(huì)疊加或互補(bǔ)從而引起協(xié)同作用，尚需研究驗(yàn)證。本研究中發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用僅能增加部分組分的Cmax，對(duì)AUC0-∞沒有顯著影響，協(xié)同作用是否與Cmax的增加相關(guān)亦需進(jìn)一步考察。

本研究中，在確定比格犬給藥劑量時(shí)，根據(jù)三七總皂苷粉針和燈盞花素粉針的臨床推薦劑量，采用了按體表面積直接轉(zhuǎn)換法、按mg·kg-1折算mg·(m2)-1轉(zhuǎn)換因子計(jì)算法、按照每千克體質(zhì)量占體質(zhì)量表面積相對(duì)比值計(jì)算法、按照人與各種動(dòng)物以及各種動(dòng)物之間用藥劑量換算法分別計(jì)算給藥劑量，取最大值作為最終實(shí)驗(yàn)用量，以為后期人體試驗(yàn)研究提供更為安全的數(shù)據(jù)支持。