鐵皮石斛無菌納米粉抗慢性肝損傷及對肝組織超微結構的影響*

徐博，吳畏難，沈楠，安英

(1.吉林醫藥學院基礎醫學院，吉林 132013；2.吉林市中心醫院普通外科，吉林 132011)

鐵皮石斛在民間素有“救命仙草”之稱，具有抗肝損傷、增強免疫、抗疲勞、抗氧化、促消化、抗腫瘤等功效[1]。由于滋陰潛陽作用和廣泛的保健功效，鐵皮石斛一直被視為石斛中的珍品[2-3]。本課題組前期研究表明，鐵皮石斛普通粉(dendrobium officinale powders，DOP)在改善肝功能和護肝方面具有一定的療效。但因其價格昂貴，臨床應用始終受限。近年來研究的納米中藥有許多新的特點和功能，可以降低患者用藥量，節約有限的中藥資源，降低不良反應，提高生物利用度、靶向性，呈現新藥效，拓寬原藥適應證[4]。筆者采用納米技術改變粒徑大小，精制成鐵皮石斛無菌納米粉(dendrobium officinale nanoparticles，DON)，豐富了中藥的劑型選擇，目前文獻中對其保護肝損傷在藥效和機制方面的研究報道較少，因此，本實驗通過建立小鼠肝損傷模型，觀察DON對相關生化指標、炎癥因子表達、肝臟病理及肝細胞超微結構改變等方面的影響，探討其作用機制[2，5]，報道如下。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 鐵皮石斛(浙江鐵楓堂藥業有限公司)，DON[采用超臨界反溶劑法聯合高壓蒸汽滅菌法制備，經納米粒度儀測定平均粒徑為(100±30)nm]，DOP(粒徑0.425 mm)，均由北華大學藥學院根據實驗所需粒徑要求制備并鑒定。護肝片(吉林省松遼制藥公司)；四氯化碳(CCl4，天津市光復科技發展有限公司)；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶 (AST)、乳酸脫氫酶(LDH)和過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-6酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)；IL-1β抗體(武漢愛博泰克生物科技公司)。

1.2實驗儀器與設備 SALD-7500nano納米粒度儀(日本島津公司)，PM100行星式球磨儀(德國Retsch公司)，酶標儀(美國伯樂公司)，HPX-9052MBE電熱恒溫培養箱(上海博迅醫療設備廠)，BX53正置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，Tecnai G2 Spirit透射電子顯微鏡(美國Thermo Fisher公司)。

1.3實驗動物 清潔級昆明種小鼠40只，雌雄兼用，體質量(20±2) g，購至吉林大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(吉)：2009-0005。室溫常規飼養，相對濕度75%，每天換水1次，每天光照12 h。

1.4方法

1.4.1分組、造模和給藥方法 小鼠40只，隨機分為4組，分別為正常對照組、模型對照組、DON組和DOP組各10只，正常對照組灌胃給予純化水，DON組和DOP組按相應藥物劑量(0.30 mg·kg-1)給予，每天1次。造模為每周2次(星期一、星期四)，給藥后1 h，除正常對照組外，各組分別皮下注射20%CCl4花生油溶液(2 mL·kg-1)，正常對照組給予同等劑量花生油溶液。給藥和造模均為第1周的星期一開始給藥，共8 周。末次造模藥給予12 h后，采集各組小鼠血清和肝組織標本，進一步行肝功能生化指標(每組10只)、肝病理學檢測及電鏡觀察(隨機選取每組3～5只)[6]。

1.4.2檢測生化指標 嚴格按試劑盒說明書檢測AST、ALT、LDH、CAT、TNF-α及IL-6含量。

1.4.3免疫組化法檢測肝組織中IL-1β的表達 取肝組織0.1 g，置10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋并切片，二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，免疫組化法處理，具體流程按試劑盒說明書操作。晾干后置于顯微鏡下觀察并攝像。用Motic Images Advanced 3.2版軟件對免疫組化染色結果進行分析。

1.4.4蘇木精-伊紅(HE)染色觀察小鼠肝臟組織結構改變 血液標本收集完畢，處死大鼠，取整個肝左葉，置10%甲醛溶液固定，用于制作HE 染色切片，在光學顯微鏡下觀察肝臟病理組織學改變。

1.4.5小鼠肝臟電鏡超微結構觀察 同上處理，取肝右葉1 mm3，置2.5%戊二醛溶液固定，制作電鏡切片(由上海賽新生物科技有限公司完成)，透射電子顯微鏡觀察肝臟超微結構改變。

2 結果

2.1DON對小鼠血清AST、ALT、LDH、CAT活力的影響 見表1。與正常對照組相比，模型對照組AST、ALT、LDH活力顯著升高(P<0.01)，CAT活力明顯降低(P<0.01)；與模型對照組比較，DON和DOP組，血清 ALT、AST 、LDH水平均顯著下降(P<0.05，P<0.01)，CAT活性增強(P<0.05，P<0.01)； 同等劑量下，與DOP組比較，DON組AST、ALT活力顯著降低(P<0.05)，CAT活力顯著升高(P<0.05)。

表1 4組小鼠血清AST、ALT、LDH、CAT活力比較 Tab.1 Comparison of the serum activity of AST，ALT，LDH and CAT among four groups of mice

2.2DON對小鼠血清TNF-α和IL-6含量的影響 見表2。與正常對照組比較，模型對照組TNF-α和IL-6含量顯著增加(P<0.01)；與模型對照組比較，DON組和DOP組TNF-α和IL-6含量均明顯降低(P<0.05，P<0.01)； 與DOP組比較，DON組TNF-α和IL-6含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)，DON更明顯減輕肝損傷導致的炎癥反應。

2.3肝組織中IL-1β的表達 見圖1。IL-1β在細胞質中表達的目標蛋白為棕黃色。與正常對照組比較，模型對照組小鼠肝臟組織中 IL-1β表達明顯增加(t=27.10，P<0.01)；與模型對照組比較，DON組和DOP組IL-1β表達均明顯降低(t=4.28，P<0.05，t=15.63，P<0.01)；與DOP組比較，DON組IL-1β表達顯著降低(t=14.33，P<0.01)。

圖1 4組小鼠肝組織中IL-1β的表達 (×200) Fig.1 IL-1β expression in livers in four groups of mice(×200)

2.4DON對肝損傷小鼠肝組織病理學的影響 見圖2。光鏡顯示，正常對照組小鼠肝組織具有完整的結構，無炎癥細胞浸潤，無變性或壞死，肝小葉和肝竇清晰規則且整齊排列，肝細胞呈索放射狀分布于中央靜脈周圍； 模型對照組肝組織呈現出紊亂的肝小葉結構和肝細胞索，肝細胞腫脹變大呈圓形且大小不勻，與周圍組織界限不清，有程度不同的壞死，肝細胞內可見大小不一空泡，并有氣球樣及水樣變性，肝竇變形變窄；DON組和DOP組肝細胞細胞質水樣變性及氣球樣變有所改善，炎癥損傷、炎癥細胞浸潤較模型對照組均有不同程度改善，其中DON組最為明顯。

圖2 4組小鼠肝臟組織的病理學變化(×200) Fig.2 Pathological changes of livers in four groups of mice(×200)

表2 4組小鼠血清TNF-α和IL-6含量比較 Tab.2 Comparison of the serum level of TNF-α and IL-6 among four groups of mice

2.5DON對肝損傷小鼠超微結構變化的影響 見圖3。正常對照組肝細胞結構完整，核仁明顯，肝細胞質中線粒體、內質網等細胞器形態正常，結構清晰，線粒體嵴排列規整，內質網豐富；模型對照組肝細胞內質網斷裂，細胞質內線粒體腫大甚至破裂或變形，數量減少，可見彌漫散在分布大小不等脂滴，部分肝細胞正常結構消失； DON組和DOP組與模型對照組比較，肝細胞的超微結構明顯改善，其中DON組肝細胞結構逐漸接近正常，核周圍脂滴數量及分布均有改善，仍有損傷性肝細胞結構，但腫脹線粒體少，且腫脹程度較輕，粗面內質網增多，部分輕度擴張。

圖3 4組小鼠肝組織超微結構變化(×5000) Fig.3 Ultrastructural changes of livers in four groups of mice(×5000)

3 討論

本實驗結果顯示，提前給予DON可顯著抑制CCl4攝入所引起的血清中ALT、AST、LDH的活性升高和CAT活性降低。提示DON對小鼠受損的肝功能和肝臟組織具有改善與修復作用，且明顯優于DOP。

單核細胞或巨噬細胞在CCl4作用下向肝臟積聚，致敏的巨噬細胞會釋放一些炎癥遞質 ( 如自由基、IL-1β 和 TNF-α 等)，誘發炎癥，從而造 成 肝 細 胞 損 傷。其中，TNF-α 是最關鍵的細胞因子之一[7]。釋放細胞因子水平較低時，IL-1β的細胞生物學效應主要有兩方面，其一可引起組織局部炎癥反應，其二可進一步促進 IL-6 合成[8]。本實驗發現，DON比DOP更顯著降低TNF-α、IL-1β 水平，可能是其保護CCl4致慢性肝損傷的重要因素之一。

光鏡下模型對照組肝組織發生了明顯的改變，且呈彌漫性，并伴有炎細胞浸潤和壞死，顯示造模效果良好。用DON干預后，可見受損的肝細胞有明顯修復，細胞質水樣變性及氣球樣變有所改善，且比DOP組顯著[9-10]。

透射電鏡可以觀察肝臟線粒體結構的損傷情況[11]，本實驗結果顯示，模型對照組可見線粒體出現腫脹，線粒體內峭模糊，外膜破損，空泡樣改變，基質密度不同程度降低，粗面內質網減少等超微結構變化。DON組和DOP組肝細胞的超微結構改善，細胞內脂滴減少，脂滴的聚集顯著減少，細胞核變圓變大。DON比DOP的抗炎作用更明顯。DON對慢性肝損傷小鼠無論肝臟病理組織學還是肝細胞超微結構都表現出了一定的保護作用，這為鐵皮石斛納米化應用于臨床提供了理論依據。

納米化后的鐵皮石斛具有更強的清除自由基、抗氧化、抗炎作用，肝靶向性顯著增強，可清除體內大量的自由基，從而達到更好的保護肝臟細胞的作用。綜上所述，無論從肝功能指標還是組織學結果分析均顯示DON對肝臟的保護作用優于其未納米化。