清胰煎劑與顆粒中4種成分在大鼠體內的藥動學比較*

歐水平，鄭小翠，王森，3，陳靈，王玉和 ，任麗

(1.遵義醫科大學附屬醫院藥劑科，遵義 563000；2.遵義醫科大學藥學院，遵義 563003；3.畢節市第一人民醫院藥學實驗室，畢節 551700)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床常見的急腹癥，發病急，進展快，死亡率高，極易發展為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)。SAP病情兇險，常伴有局部或全身炎癥反應綜合征及全身多器官功能障礙[1-2]。AP的病因和發病機制是一個復雜、多因素參與的病理過程，胰酶激活和胰腺自身消化、胰腺微循環障礙等均會引起AP[3-4]。目前AP治療主要包括中醫、西醫及中西醫結合治療[5]。西醫治療主要包括手術、鎮痛、液體復蘇等。中藥治療AP主要有中藥單體、單味中藥和復方。用于治療AP的中藥方劑主要有大承氣湯、茵陳湯、清胰湯等[6]。清胰煎劑來源于遵義醫科大學附屬醫院臨床經驗方，現已記載于《古今名方》，由大黃、赤芍、炒梔子、木香、姜厚樸、醋延胡索、丹皮及芒硝等8味藥組成，組方嚴謹，遵循中醫治療急腹癥以“通”為用的原則，諸藥合用共奏疏肝理氣、清熱解毒、鎮痛、通里攻下之功效。我院臨床應用已有五十多年的歷史，療效確切，能顯著提高 AP 及 SAP 的治愈率[7]。目前，清胰制劑是以煎劑應用于臨床，雖然煎劑與中醫辨證診治、隨癥加減的原則一致，但體積大，易腐壞，攜帶、儲存不便，制備麻煩且難以控制質量等，不適宜工業化批量生產。顆粒劑既克服了煎劑易霉變、質量難控等缺點，也保持了煎劑吸收和作用迅速的優點。筆者前期也對清胰制劑的研究概況進行了總結[7]。在前期研究的基礎上，筆者采用液相色譜-串聯質譜聯用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS/MS)方法研究清胰煎劑與顆粒中蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚在大鼠體內的藥動學特征，為清胰顆粒的研制和臨床應用提供參考。

1 實驗材料

1.1實驗動物 清潔級雄性SD大鼠10只，體質量250～280 g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，合格證號SCXK(湘)2014-0011。飼養環境溫度(25±1) ℃，相對濕度( 55±2)%，每天光/暗交替 12 h/12 h。本實驗經遵義醫科大學動物倫理委員會批準，批準號：倫審[2017]2-083號。

1.2試藥 蘆薈大黃素、大黃酚(成都曼思特生物科技有限公司，批號分別為MUST-17030605，MUST-17030603，含量均>98%)，大黃素、大黃酸(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110756-201512，110757-201607，含量>98%)，1，8-二羥基蒽醌(成都埃法生物科技有限公司，批號：AF8022701)，甲醇(色譜純，瑞典Oceanpak公司，批號：17110609G104)，清胰煎劑、清胰顆粒(遵義醫科大學附屬醫院藥劑科自制，批號分別為：201807101，2018071101)，其余試劑均為分析純。

1.3儀器 4000Q TRAP LC/MS/MS液質聯用儀(美國AB SCIEX公司)，Sartorius BT125D分析天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司，感量：0.01 mg)，TGL16M型臺式高速冷凍離心機(長沙邁佳森儀器設備有限公司)，TGL-16C高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，IKA Vortex 1渦旋儀(德國IKA 公司)，DURA12型超純水機[澤拉布儀器科技(上海)有限公司]。

2 方法與結果

2.1清胰煎劑及清胰顆粒的制備及質量控制 遵循清胰煎劑臨床水煎煮制備工藝，確定按文獻[8-9]方法制備清胰煎劑濃度相當于生藥量2 g· mL-1。取處方量藥材，加入10倍量65 ℃水浸泡30 min(芒硝除外)，煎煮3次，每次20 min，過濾，合并3次濾液，取適量溶解芒硝，其余55 ℃減壓濃縮成稠浸膏，70 ℃減壓干燥得干浸膏，粉碎過篩孔內徑0.18 mm(5號)篩，即得浸膏粉。按比例稱取浸膏粉與輔料混勻，加入一定量濃度的乙醇，制得軟材，擠壓過篩制粒，干燥0.5 h，過篩孔內徑2.00 mm(1號)與篩孔內徑0.25 mm(4號)篩整粒即得清胰顆粒。稱取清胰顆粒適量，加熱水攪拌溶解，使其濃度為0.91 g· mL-1(相當于生藥量2 g· mL-1)，即得清胰顆粒溶液，使用時再次攪拌均勻。課題組前期對清胰煎劑及清胰顆粒的制備工藝進行了篩選及優化，建立了質量控制方法[9]及質量標準，并考察了制劑的穩定性。研究結果表明，制備工藝合理穩定可行，建立的質量標準及質量控制方法準確、簡便、重復性好，穩定性良好。

2.2對照品溶液的配制 分別精密稱取蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、1，8-二羥基蒽醌(內標)對照品適量，加少量三氯甲烷溶解后，加入甲醇制成濃度依次為0.435，0.202，0.50，0.50，0.40 mg· mL-1的對照品溶液。分別精密吸取上述蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚單個對照品溶液300，170，1600，480 μL于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度得濃度分別為3.48，3.45，80.00，24.00 μg· mL-1的混合對照品溶液。加甲醇等比稀釋成梯度濃度混合對照品溶液。另將內標稀釋為1 μg· mL-1溶液備用。

2.3測定方法建立

2.3.1色譜/質譜條件 采用UItimate LP-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫：25 ℃，流速：0.8 mL·min-1，0.1%甲酸溶液-甲醇(15：85)等度洗脫，進樣量5 μL。采用ESI負離子檢測，多反應監測(multi-reaction monitoring，MRM)模式測定。主要參數為離子化溫度550 ℃；噴霧電壓4500 V，氣簾氣壓力276 kPa；霧化氣壓力448 kPa；輔助加熱器壓力448 kPa；碰撞氣Medium，各成分與內標m/z、碎片能量及撞擊能量見表1。

表1 4種成分及內標 MRM檢測模式參數 Tab.1 Parameters for MRM detection mode of four analytes and internal standard

2.3.2樣品處理 取血漿 200 μL至離心管，加入1 μg· mL-1內標溶液10 μL，渦旋1 min，加甲醇100 μL，渦旋1 min，加入鹽酸溶液(0.1 mol·L-1)200 μL，渦旋1 min混勻后加7倍量乙酸乙酯，渦旋7 min，離心(5000 r·min-1，r=10 cm，5 min)，取有機層氮氣吹干，加甲醇100 μL渦旋 2 min復溶，離心(12 000 r·min-1，r=10 cm，5 min)，取上清液進樣分析。

2.3.3方法學考察

①專屬性考察。取大鼠空白血漿、空白血漿+內標、空白血漿+混標溶液+內標，給藥后血漿樣品，經“2.3.2”項下方法處理后，按“2.3.1”項下方法進樣測定。結果表明，空白血漿中內源性雜質均能與蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、內標色譜峰分開，不干擾測定。

②線性關系和定量限。取空白血漿200 μL，分別精密加入系列質量濃度的混合對照品和內標各10 μL，按樣品處理方法處理，進樣分析。采用加權(W=1/X2)最小二乘法，以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚峰面積與內標峰面積的比值(Y)對濃度(X)作線性回歸，結果標準曲線方程依次為Y=0.012 6X+0.006 3(r=0.994 9)，Y=0.315 0X+0.044 6(r=0.999 0)，Y=0.042 6X+0.128 0(r=0.997 1)，Y=0.062 4X-0.074 20(r=0.999 9)，Y=0.205 3X+0.006 4(r=0.999 7)，線性范圍依次為5.10～652.50，1.35～172.38，31.25～4000，9.38～1200 ng· mL-1，表明各成分在各自濃度范圍內線性關系良好，最低定量限依次為5.10，1.35，31.25，9.38 ng· mL-1。

③精密度與準確度實驗。取大鼠空白血漿200 μL，精密加入混合對照品溶液，配制各成分低、中、高濃度的質控樣品各5份，按照“2.3.2”項下的方法處理，測定3 d，代入隨行標準曲線方程求得各成分濃度，計算日內、日間精密度。結果見表2，表明蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚的日內、日間精密度RSD值均小于15%，日內、日間準確度均在±15%范圍內，符合生物樣本測定要求。

④回收率與基質效應實驗。取空白血漿樣品200 μL，精密加入混合對照品和內標溶液，制備各成分低、中、高3個濃度的質控樣品各5份，經“2.3.2”項下方法處理，進樣測定得峰面積為A，另取空白血漿，同法處理后，加入等量低、中、高濃度對照品和內標溶液，測定得峰面積為B，測等量未經處理的3 個濃度的工作溶液峰面積C。回收率=A/B，基質效應=B/C。結果見表2，表明蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚4種成分提取回收率和基質效應均在 80%～110%之內，均符合標準，本方法測定條件下血漿中內源性雜質對各成分的測定沒有影響。

表2 4種成分血漿樣品的精密度、準確度、回收率與基質效應 Tab.2 Precision，accuracy，recovery and matrix effects of four analytes in plasma %，n=5

⑤穩定性實驗。取空白血漿樣品200 μL，分別精密加入混合對照品，配制成高、中、低3種濃度的樣品各5份，分別于室溫條件下存放24 h，-20 ℃冷凍-室溫融化循環3次，-20 ℃存放2周后，按“2.3.2”項下方法處理，測定。結果表明4種成分在3種條件下測得濃度RSD值均小于15%，說明樣品穩定性良好。

2.4藥動學研究 雄性SD大鼠10只，給藥前均禁食12 h，自由飲水，按體質量隨機分為清胰煎劑組和清胰顆粒組，分別按26 g·kg-1量灌胃給“2.1”項下制備的清胰煎劑和顆粒溶液。于給藥后0.083，0.25，0.5，1，2，3，4，6，8，12，24 h眼眶靜脈取血1 mL，存于有肝素鈉的尖底離心管中，4 ℃離心(5000 r·min-1，r=10 cm，10 min)，取血漿200 μL。按“2.3.2”項方法處理，按“2.3.1”項方法分析，計算各時間點大鼠血漿中蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚的血藥濃度。將其他成分血藥濃度數據用PkSolver軟件，選擇非房室模型處理[10]，清胰煎劑組和顆粒組活性成分的藥動學參數見表3。

表3 清胰煎劑及顆粒中 4種成分的主要藥動學參數 Tab.3 Pharmacokinetic parameters of four analytes after oral administration of Qingyi decoction and granules

結果表明，清胰顆粒組蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸的達峰時間(tmax)均比煎劑組提前；大黃酚延緩25 min。顆粒組大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素Cmax略低于煎劑組；大黃酚兩組基本相等。煎劑組蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚AUC0-∞比顆粒劑組稍大。采用SPSS 16.0版軟件對兩組主要藥動學參數進行統計學分析，結果表明，清胰顆粒組4種成分所有藥動學參數(tmax、t1/2、Cmax、AUC0-∞、MRT0-∞、Vz/F、CL/F)與煎劑組相比均差異無統計學意義，表明清胰顆粒劑和煎劑具有相似的藥動學特征。

3 討論

本研究對清胰制劑的君藥大黃中有效成分蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚的血藥濃度進行測定，比較清胰傳統煎劑與顆粒在大鼠體內的藥動學特征，實驗選擇乙腈、甲醇沉淀蛋白，乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷萃取處理樣品，結果發現采用萃取法處理樣品，大黃酸的提取率和基質效應只有50%，采用沉淀蛋白法時蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸的提取率和基質效應比較低。大黃中蒽醌類成分主要有結合型和游離型，結合蒽醌進入體內后，經過腸道菌群代謝為游離蒽醌進而發揮作用[11]。本實驗測定游離蒽醌，結果表明該方法處理樣品空白血漿的干擾較小，提取回收率和基質效應均高，線性關系、精密度、穩定性良好。

本研究結果顯示，清胰顆粒中4種成分主要藥動學參數與煎劑比較差異無統計學意義，說明兩劑型具有相似的藥動學特征。兩種劑型均吸收迅速，適用AP發病急、進展快的特征。總體上，煎劑AUC比顆粒劑稍大，煎劑的生物利用度稍大，顆粒血藥濃度達峰時間比煎劑快，這可能由于清胰顆粒中加入了輔料，促進藥物吸收，使得顆粒組的達峰時間提前。同一組不同的大鼠之間差異較大，一是由于動物自身的差異，二是由于處方中的君藥大黃有瀉熱通便、攻積滯的功效，實驗過程中發現所有大鼠均存在腹瀉現象，且發生腹瀉的時間與程度不一，對藥物吸收產生不同程度影響。中藥成分復雜，復方更是如此，且配伍后相互影響，難全面闡明中藥復方的吸收、分布、代謝和排泄規律。文獻[10，12]報道無論是單味大黃給藥還是復方制劑給藥，大黃中游離蒽醌類成分在體內吸收快，但消除較慢，大黃素、大黃酸、大黃酚和蘆薈大黃素在給藥后24 h可檢測到。大黃酸在大鼠血漿中的濃度明顯高于大黃素、蘆薈大黃素和大黃酚，這可能是由于大黃酸在清胰煎劑與顆粒中含量最高，而另外3種成分含量較低，且大黃素和蘆薈大黃素能在體內被氧化并轉化為大黃酸[13]。番瀉苷A是大黃蒽醌類衍生物以及蒽酮與葡萄糖結合形成的苷類，在體內能被β-葡萄糖苷酶代謝為蒽酮，再氧化得到其苷元大黃酸[14]。因此，這在一定程度上增加了大鼠體內大黃酸濃度，而大黃素甲醚在體內的含量較低無法檢測。這些均與本實驗研究結果基本一致。本研究為清胰制劑的臨床應用提供了實驗依據。