ANGPTL2 基因甲基化及臨床指標與冠心病病變程度的關聯性研究

陳麗，周建慶，廉姜芳

血管生成素樣蛋白2（ANGPTL2）基因位于人類基因的9 號染色體，作為一種在心臟等器官豐富表達的分泌型糖蛋白，ANGPTL2 蛋白與心血管疾病之間存在密切的聯系[1-2]。但ANGPTL2 在冠心病中的具體機制尚不清楚。筆者前期研究證實了ANGPTL2 基因啟動子區的低甲基化水平與冠心病的發病風險存在關聯[3]。本實驗進一步探索ANGPTL2啟動子位置甲基化水平與冠心病嚴重程度的關系，同時探討臨床常見指標與冠脈病變程度的相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取寧波市醫療中心李惠利醫院2018 年1 月至2019 年1 月期間行冠脈造影的134 例患者，排除：（1）左室射血分數（LVEF）＜35%的重度心功能不全；（2）先天性心臟??；（3）感染性發熱；（4）糖耐量異常；（5）嚴重腎臟、肝臟功能異常；（6）癌癥；（7）有器質性心臟?。唬?）患有風濕免疫系統疾病。其中冠心病組94 例，正常冠脈組40 例。入選的所有患者都了解研究目的并知情同意，且簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集患者基本資料，包括年齡、性別、是否抽煙、是否患有高血壓、以及生化指標｛總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDLC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、載脂蛋白A（ApoA）、載脂蛋白B（ApoB）、載脂蛋白E（ApoE）、脂蛋白a[Lp（a）]、C反應蛋白（CRP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）｝。

1.2.2 評定標準[4]所有患者均行冠狀動脈造影手術。依據冠脈造影結果和病變累及范圍將病變組分為單支、雙支和多支病變組。對不同患病組的參與者分別進行Gensini 評分。

1.2.3 檢測指標 采集參與者靜脈血8ml，使用基因組抽提試劑盒提取外周血標本的基因組DNA。得到的基因組DNA 使用亞硫酸氫鹽方法處理，對甲基化的DNA 堿基進行轉化修飾，然后純化回收，通過PCR 擴增DNA 序列。由Pyro-Mark Assay Design 2.0 設計引物序列（表1），最后應用焦磷酸測序分析不同CpG位置的甲基化程度（圖1）。

圖1 ANGPTL2 基因某一樣本的焦磷酸測序結果

表1 ANGPTL2 基因引物

1.3 統計方法 采用SPSS 21.0 統計軟件進行處理。正態分布計量資料以均數±標準差表示，兩組比較獨立樣本t 檢驗，多組比較采用單因素方差分析；非正態分布計量資料以M（P25，P75）表示，多組比較運用Cruskal-Wallis H 檢驗，兩組比較運用Mann-Whitney U 檢驗；計數資料用2檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析或Spearman 相關分析。P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同冠脈病變支數的冠脈造影Gensini 評分比較 不同冠脈病變支數組Gensini 評分差異有統計學意義（P ＜0.05），其中多支冠脈病變組Gensini 評分大于雙支病變組和單支病變組的評分（均P ＜0.05），雙支組和單支組的評分差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表2。2.24 組臨床特征分析 與正常冠脈組比，多支冠脈病變組中男性明顯多于女性（P ＜0.05），高血壓和吸煙人數更多（均P ＜0.05）。4 組Lp（a）、CRP 水平差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。見表3。

表2 同冠脈病變支數的冠脈造影Gensini 評分比較 分

表3 4 組臨床特征比較

2.3 ANGPTL2 甲基化程度與冠脈病變支數的相關性 CpG4 位點與其他位點之間r ＜0.8，相關性不大。其余四個位點（CpG1、CpG2、CpG3、CpG5）兩兩之間r ＞0.8，存在較高相關性。因此本研究只分析這4 個位點平均甲基化水平和CpG4 單個位點的甲基化水平。4 組CpG1、CpG2、CpG3、CpG5 的甲基化均值和CpG4 甲基化值差異均有統計學意義（均P ＜0.05），正常冠脈組的CpG1、CpG2、CpG3、CpG5 甲基化水平高于冠脈病變各組，而多支病變組低于單支和雙支組（均P ＜0.05）；多支病變組的CpG4 甲基化水平低于其他組（均P ＜0.05），而單支和雙支病變組與正常冠脈組相近。見表4。Gensini評分與CpG1235位點以及CpG4 位點的甲基化水平密切相關（r=－0.415、－0.205，均P＜0.05）。

表4 4 組ANGPTL2 基因啟動子區甲基化程度比較

3 討論

ANGPTL2 作為一種血管內皮生長因子，可以通過多種調控途徑在生理及病理生理上起到重要作用。此外，其也可以通過激活內皮細胞內的炎癥信號促進血管的炎癥反應，從而導致動脈粥樣硬化的生成與發展[5]。脂肪組織在分泌促炎細胞因子的同時還分泌脂聯素等抗炎因子，兩者間存在一種動態平衡，這種平衡發生紊亂，就會導致慢性炎癥狀態。ANGPTL2 也是一種脂肪因子，因此它在血管壁慢性炎癥中也發揮著重要作用[2，6]。有研究報道ANGPTL2 可以阻遏血小板的聚集和活化[7]，這提示ANGPTL2 一方面能夠促進血管的炎癥反應，而另一方面又起到了防止血栓形成的作用。

有研究證實ANGPTL2 蛋白與冠脈病變嚴重程度存在密切聯系[8]。本研究顯示不同冠脈病變支數組Gensini評分、Lp（a）及CRP水平差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。本研究進一步探究了ANGPTL2基因啟動區5 個位點（CpG1、CpG2、CpG3、CpG4、CpG5）的甲基化水平與冠脈病變嚴重程度的相關性。實驗證實ANGPTL2 基因啟動子區域的CpG位點甲基化水平與Gensini評分呈負相關性。單支、雙支和多支病變組的CpG1、CpG2、CpG3、CpG5 位點的甲基化水平低于正常冠脈組，其中多支病變組所有CpG位點甲基化程度均低于正常冠脈組、單支病變組和雙支病變組，但是本研究未發現單支與雙支病變組間各個位點甲基化水平存在顯著差異，這可能需要擴大樣本量后進一步研究。有研究證實基因啟動子區的甲基化能夠有效降低轉錄因子與啟動子的結合能力，從而影響下游基因的轉錄[9]，因此推測ANGPTL2 的CpG 位點甲基化水平越低，外周血中ANGPTL2 蛋白表達越高，冠脈狹窄越嚴重。這可能是由于ANGPTL2 蛋白促進冠狀動脈血管壁炎癥、巨噬細胞的浸潤以及血栓形成，進而導致動脈粥樣硬化發生。

本研究初步揭示了ANGPTL2 基因啟動子區甲基化水平與冠脈病變嚴重程度呈負相關，為后續研究ANGPTL2 與冠狀動脈疾病的具體聯系提供了相關臨床數據，將有助于冠心病的臨床治療。但本實驗并未證實ANGPTL2 基因甲基化與冠心病之間的因果關系，需要進一步隊列研究。同時本研究檢測了相關臨床指標與冠心病之間的相關性，明確冠心病危險因素和保護因素，為冠心病的預防和治療提供理論依據。