骨髓間充質干細胞玻璃體腔內注射對外傷性視神經損傷的修復作用研究

謝佩玲，張俐娜，何娜，南開輝

外傷性視神經病變（TON）是顱腦外傷常見合并癥狀之一，在交通、高空墜落等事故中多見[1]。目前臨床對于間接性TON治療尚未達成共識，推薦治療方法有靜脈注射大劑量糖皮質激素和經顱或經篩竇視神經管減壓術，但神經損傷修復再生治療效果不穩定，治療效果不佳主要與視網膜神經節細胞（RGCs）存活數量以及軸突再生關系密切[2-3]。為改善TON患者的治療效果，研究者們致力于探索其他治療手段如基因治療、干細胞治療用于視神經損傷修復再生，干細胞用于中樞神經損傷治療作用在不同疾病模型研究中分別得到了證實[4-5]，然而，干細胞在TON 中的具體作用及其機制研究相對較少。本研究選擇大鼠視神經夾傷模型，經由玻璃體腔內注射骨髓間充質細胞（BMSC），研究其對RGCs的保護及其軸突再生作用。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 細胞培養基DMEM/F 12（1∶1）（1X）、胎牛血清、胰酶（0.25% trypsin-EDTA）等購自美國Gibco 公司，死活染色試劑盒（Live/dead Viability assay）購自美國Invitrogen 公司，光學相干斷層掃描儀（OCT）購自美國Tissue-Tek 公司，Triton X-100 購自北京Solarbio 公司，氧氟沙星軟膏購自沈陽興齊眼藥有限公司，霍亂毒素B 亞基（CTB）購置美國Invitrogen 公司。實驗動物與分組：選取72 只健康SD大鼠，6～8 周齡，重量180～210 g，隨機分為3 組：TON+BMSCs 注射組（BMSCs 組）、TON+磷酸鹽緩沖溶液（PBS）注射組（PBS 組）和假手術組（Sham組），每組各24 只。BMSCs 組、PBS 組大鼠行眶內段視神經鉗夾傷造模，Sham 組只暴露視神經。各組分別于造模后第3、7、14、28 天處死6 只大鼠。第25天在各組剩余的6 只大鼠玻璃體腔內注射CTB。

1.2 方法

1.2.1 TON 模型建立 先將大鼠放入含3%異氟烷的氧氣、空氣（1∶1）混合氣體誘導箱內誘導麻醉5 min，大鼠翻身反射消失后，繼續予含1.5%異氟烷的氧氣、空氣（1∶1）混合氣體經面罩維持麻醉。大鼠置于手術臺，局部應用鹽酸丙美卡因滴眼液滴左眼予以表面麻醉處理。剃毛刀剔除眼瞼及眶周部分毛發，0.5%聚維酮碘溶液清潔備皮區及結膜囊，用角膜剪自左眼外眥處開始向顳側皮膚做長約6 mm的皮膚切口，注意勿損傷外眥靜脈等較大血管；使用5-0 絲線將切口兩側皮瓣縫合于切口兩側皮膚，牽拉暴露切口范圍。用角膜剪向結膜下穹窿部剪開結膜，暴露眶周脂肪并剪除遮擋視野部分，注意勿損傷眼外肌及血管；角膜剪剪除部分眶周脂肪，顯微鑷分離肌錐，暴露視神經（封三彩圖3a）。在眼球后2 mm 處將顯微鑷（頭部寬度為0.1 mm，WA3010，中國金鐘）尖端完全閉合鉗夾視神經持續6 s（封三彩圖3b～c）。縫合切口后涂抹眼膏防止感染，腹腔注射0.05 mg/kg 布洛芬鎮痛。BMSCs 組構建TON 模型后玻璃體注射BMSCs，PBS 組構建TON 模型后玻璃體注射PBS，Sham 組暴露視神經后不做夾持處理。

圖3 經顳側皮膚入路暴露視神經并構建視神經鉗夾傷模型

1.2.2 BMSCs 培養與注射 另選取SD 大鼠2 只，重量80～100 g，腹腔注射10%水合氯醛溶液0.5 ml麻醉，麻醉后心臟注入5 ml空氣處死，將大鼠浸泡于75%乙醇溶液中消毒5 min，移至超凈臺內的干凈大培養皿中，分離出股骨、下肢骨，使用1 ml 注射器和BMSCs 專用培養基（含10%FBS、1%青霉素和鏈霉素的DMEM-F12 培養基）沖洗骨髓腔，收集至15 ml離心管中，1000 r/min 離心5 min，新鮮完全培養基重懸，接種于小培養瓶中，在37℃、5%CO2條件下培養。隔天換新鮮完全培養基，持續1 周，傳代至大培養瓶中，擴大培養2 代，選取細胞生長良好的P2 代進行后續試驗。BMSCs 組和PBS 組行玻璃體腔注射，Hamilton 微量注射器玻璃體腔內分別注射BMSCs 5（l細胞密度為8000 個/ml）和PBS 5l。

1.2.3 RGCs 軸突順行標記與計數 使用裝配33 G尖針頭的10l Hamilton微量注射器，玻璃體內注射5l 濃度為1 mg/ml 的CTB 594 溶液，3 d 后大鼠心臟灌注4%多聚甲醛，摘除眼球并使用4%PFA固定。顯微鏡下以視盤作為中心，將分離的視網膜放射狀剪成4 份，使用DM4B 正置熒光顯微鏡在200 倍下離視盤邊界1500m處4 個象限隨機拍照，用Image J 軟件計數每個區域的RGC 數量，并取4 個區域的平均值作為視網膜上RGC 的數量。

1.2.4 視神經切片及新生軸突計數 解剖并固定視神經，包埋、連續切片20 張后置于－20 ℃冰箱短期保存。使用Image J 軟件計數每張視神經切片距離損傷灶起始處200、500、1000、1500m 處CTB 陽性再生軸突數量；每根視神經選取3 張切片計數，并求出平均值。同時計數時測量神經的橫截面寬度（2r），用于計算每毫米神經寬度的軸突數目。∑ad 是半徑為r 的視神經中軸突距離視神經鉗夾損傷起始處距離為d 的部位再生軸突總數，通過對所有厚度為的視神經切片根據下面公式求和計算而得出

1.3 統計方法 采用SPSS20.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組RGCs 計數情況比較 在各個時間點，BMSCs 組與PBS 組RGCs 存活數量均低于Sham組，而BMSCs 組RGCs 存活數量均高于PBS 組（均P ＜0.05），見表1 和封三彩圖4～6。

表1 各組RGCs 計數情況比較 個/mm2

圖4 Sham 組在各時間點視網膜鋪片

2.2 軸突生長情況 在距離視神經夾傷起始部位200、500、1000、1500m 位置，BMSCs 組新生軸突數量高于PBS組（均P＜0.05），見表2；造模后4 周，BMSCs 組顯示有大量新生軸突穿過損傷部位，而PBS 組只有少量新生軸突，見封三彩圖7。

表2 各組軸突生長情況比較 根

圖7 玻璃體腔內注射CTB后新生軸突情況比較

圖5 BMSCs 組在各時間點視網膜鋪片

圖6 PBS 組在各時間點視網膜鋪片

3 討論

外傷性視神經病變往往造成急性的視神經損傷，導致視力部分或全部喪失。視神經鉗夾損傷是研究中樞神經系統損傷再生修復的重要模型之一，通過經眼眶暴露視神經，完全避免了對視神經的牽拉。本研究結果表明單純經眼眶暴露視神經不會造成明顯RGCs 數量的損失。本研究結果還顯示視神經損傷2 周后即有大量RGCs凋亡，而視神經如果受到損傷，其再生能力遠遠低于周圍神經。其原因如下：首先，RGCs作為高度分化細胞，在損傷后再生能力嚴重不足，這是視神經難以再生的主要原因；其次，視神經損傷后引起軸突潰變而斷裂，造成RGCs 繼發性凋亡；最后，視神經損傷后軸突再生形成磷髓酯碎片、膠質瘢痕等抑制性微環境嚴重阻礙了視神經再生[7-8]。

視神經再生包括以下幾個方面：（1）保護RGCs，避免視神經損傷后的RGCs凋亡；（2）促使RGCs軸突沿視神經方向再生，即軸突定向生長，視神經損傷后，軸突斷裂，視神經變性壞死失去功能，需要新生軸突重建功能；（3）重建新生軸突視覺信號傳導功能，即視功能重建。視神經再生干細胞移植包括多功能干細胞以及間充質干細胞。多功能干細胞通過誘導分化使其移行整合到宿主的視網膜上，補充凋亡的RGCs及生成新生的軸突；間充質干細胞對損傷后的神經元細胞給予炎癥調節、營養和神經保護支持[10-11]。BMSCs 在醫學領域已經得到廣泛的應用，其制備、質量管理、存儲、運輸等各個環節都較為成熟，為其在視神經再生領域的應用提供了保障。

本研究觀察到視神經損傷大鼠玻璃體腔內注射一定量的BMSCs不僅可以提高RGCs的存活數量，同時也促進更多的新生軸突的生長。因此，玻璃體腔注射BMSCs 有可能成為外傷性視神經損傷的新療法。但是，BMCs 促進RGCs 存活及促進軸突再生的機制需深入探討，且本研究觀察時間較短，未能重建新生軸突與腦靶區的連接及檢測視功能的重建情況，而這恰恰是神經再生難點所在，其將是后續研究關注重點。