早期高壓氧聯合康復治療對腦出血自噬蛋白Beclin-1的影響

王風波，唐明薇，王科，王瓊芬，王寶蘭

腦出血患者往往遺留嚴重的神經行為功能障礙，活動能力低下，社會參與受限，給其家庭和社會帶來一定的負擔[1]。自噬是真核細胞自我分解代謝蛋白質、衰老細胞器并再利用的重要途徑，以維持機體平衡和生存[2]。研究顯示，多種中樞神經系統疾病的發生發展均有自噬的參與，其表現為活性及相關基因的異常表達，如缺血缺氧性等腦損傷，自噬的激活可明顯降低神經細胞死亡率，被視為自噬機制對神經細胞的保護作用[3]。Beclin-1是主要自噬標記物之一，不但是衡量自噬活性或水平的重要方法，而且對自噬過程及程度的調節起著重要作用。本研究采用高壓氧聯合早期康復訓練對腦出血大鼠進行干預，觀察大鼠海馬區腦細胞Beclin-1陽性表達及神經行為學的變化，旨在探討高壓氧聯合早期康復訓練對腦出血后自噬相關蛋白活性的影響作用，以及自噬相關蛋白活性與神經行為學改變的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物與分組：健康成年雄性SD大鼠55只，體質量240～280g，由成都醫學院動物實驗中心提供[SYXK(川)2015-196]，按隨機數字表法分為空白組、非干預模型組、高壓氧組、康復訓練組、聯合干預組，每組各10只，備用大鼠5只。所有大鼠均常規飼養，實驗過程遵循國家有關實驗動物使用準則。②主要儀器及試劑：小動物顱骨鉆、腦立體定位儀(玉研科技)，高壓氧實驗艙(煙臺宏遠)，Ⅶ型膠原酶、Beclin-1兔多克隆抗體及鏈霉親和素-生物素復合物(strept avidin-biotin complex，SABC)試劑盒(武漢博士德)、山羊抗兔工作液(北京中杉金橋)、數碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪)、圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(美國Media Cybernetics)。

1.2 方法 ①腦出血模型制備：稱重后腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，頭部向上固定于腦立體定位儀，前囟區備皮，消毒，鉆孔定位左側尾狀核：前囟后1.0mm矢狀線左側3mm處，顱骨鉆鉆孔后進針5mm，微量注射器設置5min，緩慢注入膠原酶Ⅶ型溶液0.5U，留針10min，緩慢退針[4]。實驗過程中保持室溫25±2℃。空白組不予任何處置。模型制備成功標準：術后次日，大鼠清醒，神經行為學Longa評分≥2分。②干預方法：a.高壓氧：術后第3天開始，高壓氧組、聯合干預組大鼠每天按時置入高壓氧實驗艙，先純氧洗艙10min至艙內氧濃度達(90±2)%，20min勻速加壓，至2.0個絕對大氣壓后穩壓吸純氧40min(氧流量2L/min)，再20min勻速減壓出艙[5]。1次/d，連續14d。空白組、模型組大鼠不予高壓氧干預。b.早期康復訓練：術后第3天開始，康復訓練組、聯合干預組大鼠進行以下訓練[6]：細毛牙刷從頭至尾勻速刷動；網屏訓練在尺寸60×60cm，網格1cm2，距地面約50cm處，訓練大鼠四肢抓握；跑籠為圓形，直徑40cm，內徑8cm，訓練大鼠籠內奔跑；平衡木的尺寸120cm×4cm，水平置于地面上方40cm處，訓練大鼠在平衡木上行走，下方鋪以軟墊保護大鼠。所有訓練均10min/次，1次/d，連續14d。空白組、模型組大鼠不予任何康復訓練。

1.3 評定標準 ①神經行為學Longa評分：4分為神經功能嚴重受損，自發行走能力缺失；3分為向對(右)側傾倒，行走困難；2分為行走時向對側轉圈；1分為不能充分伸展對側上肢，但可自由行走；0分為無神經功能缺失癥狀[7]。②免疫組織化學Beclin-1檢測：干預7d及14d，Longa評分結束后，每組隨機各取5只大鼠麻醉后斷頭取腦，4%多聚甲醛液固定，右側海馬區腦組織石蠟包埋切片，每例組織取4張厚度約5μm切片。采用SABC法行免疫組織化學Beclin-1檢測：切片按步驟磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗及滴加山羊血清封閉液，室溫20min，滴加一抗(兔多克隆抗體，工作濃度1∶100)，4℃過夜，滴加生物素化二抗，37℃ 30min，PBS水洗3次，每次5min；PBS代替一抗為陰性對照，二氨基聯苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色[8]。光鏡下陰性細胞呈藍色，底物呈白色，陽性細胞呈黃色或棕黃色，Beclin-1陽性產物主要分布在細胞質及細胞間質。每張切片400倍光鏡下隨機選取4個視野，視野互不疊加，采集陽性細胞圖像的光密度(optical density，OD)，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測定所采集全部圖像的光密度和面積，計算每張圖像的平均光密度(average optical density，AOD)，并得出每例樣本的平均光密度。

2 結果

2.1 神經行為學Longa評分 造模大鼠死亡及Longa評分<2分各1只，剔除后隨機補充2只大鼠，以相同方法造模成功。干預7d和14d后，高壓氧組、康復訓練組、聯合干預組大鼠Longa評分較非干預模型組同時間點比較均明顯下降(均P<0.05)，康復訓練組和聯合干預組較高壓氧組組同時間點比較，Longa評分均更低(均P<0.05)，聯合干預組較康復訓練組同時間點比較，Longa評分均更低(均P<0.05)。干預14d后，高壓氧組、康復訓練組、聯合干預組的Longa評分均較干預7d時更低(均P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠Longa評分比較 分，

2.2 免疫組化檢測情況 如圖1，干預7d和14d后，非干預模型組大鼠右側海馬區腦細胞Beclin-1陽性反應較空白組同時間點比較均顯著增強(均P<0.01)，高壓氧組、康復訓練組、聯合干預組大鼠腦Beclin-1陽性反應較非干預模型組同時間點比較均明顯下降(均P<0.05)，聯合干預組的下降幅度均大于高壓氧組和康復訓練組(均P<0.05)，高壓氧組與康復訓練組之間比較差異無統計學意義。干預14d后，高壓氧組、康復訓練組、聯合干預組Beclin-1表達水平均較干預7d時進一步下降(均P<0.05)。見表2。

a.非干預模型組(細胞質及間質陽性反應顯著增強) b.高壓氧組(陽性反應下降)

c.康復訓練組(陽性反應下降) d.聯合干預組(陽性反應顯著下降)

表2 5組大鼠右側海馬區Beclin-1表達(AOD值)比較

3 討論

Beclin-1蛋白包含有450個氨基酸序列，是對自噬的發生、發展起著重要的調控作用的相關基因，同時也是檢測自噬程度的的主要標志因子之一[10]。本研究采用微量膠原酶Ⅶ型注入大鼠尾狀核區域，模擬人腦出血病程，誘發腦出血，神經行為學Longa評分均≥2分，神經功能明顯缺失，造模成功。相較空白組，模型組大鼠腦Beclin-1表達水平顯著增強，提示腦出血后腦細胞自噬機制激活，且反應強烈。自噬是細胞依賴溶酶體途徑的自我降解過程[11]，生理狀態下對維持細胞內環境的穩態有重要作用[12]，在受到損傷、缺氧缺血等應激情況下，自噬機制啟動可降解和清除受損的細胞器、蛋白質以維持正常細胞供能，提高細胞的抗損能力，一定程度上對細胞起著保護作用，但受到嚴重傷害性刺激而過度激活的自噬則可能促進細胞死亡，損傷機體[13]。近年來，自噬在神經系統疾病中的作用得到廣泛研究和驗證。有研究顯示自噬在腦損傷過程中呈時間相關性作用，因溶酶體功能障礙所致的自噬體清除功能失常，與神經元的死亡密切相關[14]。缺血性腦損傷后自噬機制如受到破壞或抑制，會導致失活細胞器及蛋白質在細胞內積聚，引發神經元死亡，而內質網的應激反應和自噬機制的激活則有利于腦損傷的緩解[15]。有學者應用糖苷類藥物干預大腦中動脈閉塞模型大鼠，抑制過度激活的自噬機制，減少神經元死亡，證實了通過抑制過度自噬可保護神經細胞[16]。

從造模后第3天開始，給予高壓氧組、康復組、聯合干預組大鼠高壓氧治療和(或)康復訓練，時機上處于腦出血急性期，契合超早期康復理念。治療進程中觀察到大鼠的精神狀態、反應力、活動、進食等逐步改善。高壓氧干預方案參照了人類普遍治療模式，即勻速加壓至2.0個絕對大氣壓后穩壓持續低流量吸純氧40 min，再勻速減壓，從入艙到出艙共80 min。結果顯示，高壓氧治療7d和14d，高壓氧組大鼠不但Longa評分均明顯低于非干預模型組，而且右側海馬區腦細胞免疫組化Beclin-1陽性反應亦較非干預模型組明顯降低。組內比較，14d的評分及檢測結果優于7d。說明高壓氧治療可有效降低腦細胞自噬相關蛋白表達，調節過度激活的自噬機制，改善腦出血大鼠的神經行為學功能，兩者呈正相關性，隨著療程的延長，治療作用可進一步顯著表現。高壓氧調節腦細胞自噬機制可能與高壓氧改善腦細胞氧代謝，清除氧自由基，抑制炎性及變態反應，調節腦微循環等有關[17-18]。

康復訓練在腦出血的干預方面已有較多研究，大多應用于腦出血恢復期，此期病情穩定，相對較為安全，但在腦出血超早期介入的方面少有報道[19-21]。對處于腦出血急性期的大鼠予軟毛刷本體感覺刺激、跑籠、平衡木及網屏等康復訓練措施，40min/次，1次/d，全程無大鼠死亡或病情加重現象。訓練7d和14d后，康復訓練組大鼠Longa評分均明顯低于非干預模型組，右側海馬區腦細胞Beclin-1陽性反應亦較非干預模型組明顯下降，組內比較，14d的評分及檢測結果優于7d。組間比較，康復訓練組的Longa評分甚至優于高壓氧組。說明腦出血超早期康復介入可安全有效地降低腦細胞自噬相關蛋白表達，調節過度活躍的自噬水平，改善神經行為學功能，兩者呈正相關性，且隨著康復介入進程，其治療作用呈增強趨勢。聯合干預組大鼠在造模第3天開始，給予相同方案的高壓氧和康復訓練聯合干預，干預7d和14d，聯合干預組的Longa評分和右側海馬區腦細胞Beclin-1陽性反應均低于高壓氧組和康復訓練組，組內比較，14d同樣優于7d，說明高壓氧聯合康復訓練對腦出血超早期的干預模式，在調節腦細胞自噬相關蛋白表達，抑制腦細胞自噬機制過度激活和改善神經行為功能方面，均較單純高壓氧或康復訓練具有更加明顯的作用。

高壓氧聯合早期康復腦出血急性期的干預優勢，在于將高壓氧與早期康復訓練的治療作用有效結合，二者相互益彰，產生更大的協調促進效應，對神經行為功能的顯著改善作用，可能與進一步調節腦細胞受損致過高的自噬水平有關。