基于PCR-DGGE技術的濃香型白酒發酵過程中微生物種群變化研究

張 洋

安徽國科檢測科技有限公司，安徽合肥 230001

中國白酒是世界上最古老的蒸餾酒精飲料之一，通常它以谷物為原料，以大曲為發酵劑，通過復雜的生化反應獲得。大曲以小麥等谷物為原料,進行固態生料發酵。大曲的類型決定了白酒的風味特征，其相應的被劃分為清香型、濃香型、醬香型和其它香型[1]。大曲作為白酒生產中主要的微生物酶源，其質量直接關系到出酒率與酒的品質。

濃香型白酒因香氣濃郁成為我國最受歡迎的蒸餾酒[2]。濃香型白酒是由谷物(高粱、玉米、大米、小麥和糯米)與作為糖化和發酵劑的濃香大曲粉混合發酵而成。濃香型大曲的制作復雜，制備需歷時將近四個月。傳統濃香型白酒大曲的制備如圖1所示。

圖1 傳統濃香白酒大曲生產工藝流程圖

傳統大曲制作采用自然接種，不添加額外的微生物。對濃香型白酒大曲微生物群落已進行了密集的研究[3-4]，但到目前為止，大多數研究集中在最終產物上。針對不同生產過程條件下濃香型白酒大曲中微生物群落的研究仍很少。另外，濃香型白酒大曲發酵過程中微生物動態與理化性質和生化特性的關系也鮮有報道。

因此，本研究利用聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)研究了濃香型大曲生產過程中細菌和真菌群落的多樣性。此外，對整個發酵過程中微生物群落的變化與理化和生化因子變化之間的關系進行了探索。本實驗研究有助于提高我們對濃香型白酒大曲發酵過程中微生物組成及演替的認識，也為今后設計更有效的大曲發酵工藝提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1酒曲

濃香型大曲樣品由安徽迎駕貢酒股份有限公司隨機從曲房上層、中層和下層抽出，然后在酒精消毒研磨機中將塊磨成粉末，將大約100 g濃香型大曲粉末樣品轉移到無菌袋中，密封置-20 ℃下保存供分析。

1.1.2主要試劑

DNA抽提試劑盒(Fast DNA? Spin Kit for Soil,MPbio,USA)，Taq DNA聚合酶 (5 U/μL，上海生工)。

1.2 主要儀器

DCode通用突變檢測系統(BioRad，Richmond，CA，USA)，成像密度計GS-710 (BioRad，CA，美國)，PCR純化試劑盒(中國上海生工)，Quantity One軟件(Quantity One 4.0.1，BioRad，美國)，電子溫度傳感器(OMEGA工程公司，美國)。

1.3 方法

1.3.1DNA 抽提和PCR擴增

使用快速DNA抽提試劑盒從各階段濃香型大曲樣品中提取總基因組DNA。利用通用細菌引物對27f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r (5′-CGGCTACCTTGTTACGAC-3′)[5]擴增16S rDNA基因的細菌V3區。為了分析真菌的多樣性，用真菌通用引物GC-Fung (5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CAT TCC CCG TTA CCC GTT G-3′)和NS1 (5′-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′)對18S rRNA基因進行了PCR擴增，目標長度～400 bp[6]。反應混合體系由5 μL的10×PCR緩沖液、3.2 μL的dNTPs(2.5 mM)、0.4 μL的Taq DNA聚合酶、1 μL的每個引物(20 μM)、5 μL的模板DNA(約50 ng)和雙蒸水(ddH2O)組成，使最終體積達到50 μL。

細菌(27f,1492r)PCR反應在94 ℃預變性5 min，94 ℃預變性30次，變性60 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃延伸10 min的條件下進行。為了分析真菌的多樣性，PCR條件為：94 ℃處理5 min，94 ℃變性35次，變性30 min，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸引物1 min，72 ℃一步擴增10 min。用Green VIEW對1×TAE瓊脂糖凝膠進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)。

1.3.2擴增產物的PCR-DGGE分析

DCode通用突變檢測系統用于PCR擴增片段的序列特異性分離。為了確定細菌群落結構，使用聚丙烯酰胺凝膠(7% (W/V)丙烯酰胺/雙丙烯酰胺凝膠37.5∶1)進行電泳，其中含有35%～55%脲甲酰胺變性梯度(100%對應于7 mol/L脲和40%(W/V)甲酰胺)，在1×TAE緩沖液中處于恒定V。在60 ℃下，56伏特為14 h。為確定真菌群落結構，用15%～35%的變性梯度的8%聚丙烯酰胺凝膠分析了引物GC-Fung和NS1獲得的PCR產物，在1×TAE緩沖液中在60 ℃恒壓100 V下進行17 h的分離。在DGGE電泳后，用AgNO3溶液對凝膠進行染色[6]。使用經校準的成像密度計GS-710，用Quantity One軟件掃描從DGGE獲得的指紋圖譜。

1.3.3DGGE 條帶的切割和測序

使用無菌手術刀片從凝膠中切取DGGE圖譜條帶。在4 ℃下，條帶放入50 μL的ddH2O中孵育，洗脫DNA。然后將2 μL的洗脫DNA按上述方法進行PCR再擴增。然后用DGGE分析每個再擴增的產物以及原始樣品的擴增產物，以確定條帶位置和純度。接著用通用PCR純化試劑盒純化已確認的PCR產物，送商業測序公司進行克隆和測序。然后將所獲得的序列與GenBank中的16S rRNA基因和18S rRNA基因序列進行比較 (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)識別同源性最強的親緣家屬。

1.3.4分析方法

電子溫度傳感器被插入大曲坯塊中心，用于連續在線檢測大曲磚芯溫度和室溫。水分、酸度、淀粉、還原糖、氨基氮、α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶和酯酶的活性測定采用大曲通用分析方法[7]。

1.3.5數據分析

使用Quantity One軟件進行群落多樣性分析。該軟件用于將每個DGGE車道轉換為密度分布圖。利用一般多樣性Shannon index指數(H)、微生物群落豐度(S)和均勻度指數(E)對DGGE結果進行分析，并根據條帶的數量和相對強度進行測定。

2 結果與討論

2.1 大曲發酵過程中細菌菌群動態變化

采用DGGE技術對大曲樣品中提取的16S rRNA基因V3區擴增片段進行了分析,得到的DGGE指紋圖譜如圖2所示。DGGE圖譜中的條帶反映了細菌群落結構和多樣性。根據平均光密度值可以計算出每個條帶豐度。

A，B，C，D，E分別代表取自大曲發酵過程中安曲、培菌期、頂火期、緩落期和打壟期的樣品。圖2 濃香型大曲發酵不同階段細菌群落16S rRNA基因的PCR-DGGE指紋圖譜

大曲發酵過程中細菌多樣性指數如表1所示。由表1可知，培菌期大曲多樣性指數高于安曲、頂火期、緩落期和打壟期，表明培菌期微生物多樣性最高。此外，細菌群落結構的條帶均勻性在培菌期樣品中也最高，表明細菌群落具有優良的均勻性。從總體物種豐富度來看(根據PCR-DGGE圖譜中單一泳道內的主要條帶數量進行估計)，培菌期(泳道B)比其它階段(泳道A、C、D和E)具有更多的條帶。

表1 濃香型大曲不同發酵階段細菌群落微生物多樣性指數

為了進一步了解濃香型大曲發酵過程中的細菌群落組成，將DGGE圖譜中出現的優勢條帶(圖2中以數字標識的條帶)從聚丙烯酰胺凝膠中切膠回收、擴增和測序。27個優勢條帶的測序結果在NCBI的GenBank數據庫中進行序列比對，確定對應條帶種屬信息。結果匯總見表2。

表2 16S rRNA V3區基因的PCR-DGGE切膠條帶的測序分析結果

2.2 大曲發酵過程中真核微生物菌群動態變化

本實驗還通過18S rDNA PCR-DGGE圖譜，揭示了大曲發酵過程中真核微生物群落的變化和大曲豐度。如圖3所示，所有樣品均呈現8～16條清晰帶，表明樣品經30%～55%聚丙烯酰胺凝膠分離效果較好。此外，頂火期中條帶15、條帶18強度較培菌期明顯增強，這可能是由于高溫促進了熱穩定性真核微生物繁殖所致。

A，B，C，D，E分別代表樣品收集自大曲發酵過程中的安曲、培菌期、頂火期、緩落期和打壟期。圖3 濃香型大曲不同發酵階段真核微生物群落DGGE圖譜

與頂火期相比，緩落期中代表真核微生物群落的條帶10、條帶11、條帶12和條帶13灰度均增強，而以條帶15和條帶16為代表的微生物數量減少，說明微生物間的競爭可能會引起微生物群落數量的改變。此外，以條帶10、條帶11、條帶12和條帶13為代表的微生物群落之間可能存在互惠共生關系。

表3顯示了大曲不同發酵階段中真核微生物群落多樣性指數變化情況。從總體物種豐度來看(根據PCR-DGGE圖譜中出現的主要條帶的數量來估計)，緩落期樣品中(圖3中標記為D)出現的條帶數最多，表明此階段樣品中真核微生物群落多樣性最大。此外，較其它期相比，緩落期樣品中條帶均勻度更高，表明該期真核微生物群落更趨于平衡。

為進一步研究大曲發酵不同階段真核微生物菌群組成，DGGE電泳后(圖3)，對其中20個主要條帶進行切膠回收、克隆、比對和測序。測序結果經GenBank數據庫比對后結果見表4。總的來說，圖3、表3和表4的數據揭示了傳統大曲培養過程中真核微生物種類的變化情況。

表3 濃香型大曲不同發酵階段真菌群落微生物多樣性指數

表4 利用BLAST技術從DGGE凝膠切出的條帶的18S rRNA基因序列的同一性

2.3 發酵過程中理化和生物指標的變化

本實驗對大曲發酵過程中的理化和生物因子的變化也進行了考察，結果見圖4。

(A)培養室溫和曲心溫度

圖4A顯示了大曲曲心溫度隨著培養時間的延長是逐漸升高的，一直達到最大值(62 ℃)，維持一段時間后逐漸下降。曲房溫度較大曲曲心溫度相比變化不大。大曲在培養過程中，水分含量是逐漸下降的，從入房安曲階段的39.1 %下降至打壟期結束后的12.2 % (圖4B)。

圖4B和圖4C顯示了偏高溫大曲總酸度、還原糖、氨基氮含量從安曲到培菌期末是逐漸增加的。這證實了在此期間，由于適宜的溫度和濕度，大曲微生物大量繁殖，促進了各種有機酸的積累，并導致總酸度進一步增加，在培菌期結束時總酸度達到最大值，為11.375 mmoL/10 g大曲。

本實驗還采用了可培養法對濃香型大曲發酵五個階段的細菌總數、霉菌數和酵母菌數進行了分析。如圖4D所示，在發酵開始時存在少量細菌(安曲)。在此階段后，細菌總數迅速增加，在培菌期結束時達到最高值。然后在頂火期細菌數量降至最低。隨著發酵溫度降低，大曲進入緩落期，此時細菌數量略有增加，但打壟期又再次下降。打壟期細菌數量下降的原因可能是由于該期大曲坯塊中低水分含量限制了大多數微生物的生長繁殖。大曲中水分能有助于調節發酵溫度。水分具有較高的熱容，能夠有效的吸收微生物代謝釋放的熱量，因而能夠防止大曲溫度增加過快。大曲中霉菌變化趨勢與細菌類似，在頂火期時，其菌數達到最大值，為2.75×106CFU/g大曲。酵母菌數在培菌期末期達到了最大值，隨后逐漸下降直至發酵結束(圖4D )。

2.4 理化、生化指標與微生物群落結構的相關性

為了研究強濃香型大曲的理化、生物指標與微生物多樣性(以Shannon-Wiener指數表示)之間的關系，進行了典型相關分析，結果見表5。水分含量與淀粉含量呈顯著正相關，與其它理化指標和生化指標呈顯著負相關。酸度與淀粉呈顯著負相關，與其它指標呈顯著正相關。還原糖、氨基氮、α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶和酯酶之間均呈正相關。該發現揭示了理化、生化指標對微生物群落的正、負效應。因此，微生物群落指標應被視為大曲質量評價的一個組成部分。大曲微生物受內部、外部環境的影響，使大曲各項指標及微生物群落結構發生相應的變化。通過對大曲各項指標的相關性的綜合分析，有助于大曲發酵微生物內部以及微生物之間的代謝機理的進一步認識，從而有助于大曲發酵條件的控制，通過發酵過程溫度、濕度、時間的控制，有意識的改變微生物群落結構及代謝產物，使大曲發酵向有利的方向進行。

表5 理化、生化指標與微生物群落結構的相關性分析

3 結論

本研究采用聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術對濃香型白酒大曲生產過程中細菌和真菌群落的多樣性進行了研究。結果表明，16S rDNA的條帶數、優勢度、多樣性和相似性在DGGE模式中明顯不同，反映了不同階段存在的細菌群落的廣泛多樣性。真核微生物群落的條帶豐度和優勢度在不同時期有所不同。大曲的理化、生物因子變化情況表明，大曲的核心溫度在頂火期上升到最大值，隨后下降。水分和淀粉含量在整個發酵過程中不斷下降。總酸、還原糖、氨基氮、α-淀粉酶活性、糖化酶活性、蛋白酶活性、細菌和霉菌在培菌期末達到最大值，進入頂火期開始下降，到達緩落期略有增加，隨后幾乎保持不變直至發酵結束。酯酶活性變化趨勢與其它酶變化趨勢相似，但其在培菌期后略有上升。酵母菌最大菌數同樣在培菌期達到最大值，隨后逐漸下降。相關分析表明，細菌和真菌多樣性分別與水分、淀粉呈負相關，與其它指標呈正相關。其中，還原糖、氨基氮、α-淀粉酶和蛋白酶與細菌呈顯著或極顯著正相關，糖化酶和酯酶與真菌呈顯著或極顯著正相關。

本研究有助于提高我們對濃香型白酒大曲發酵過程中微生物組成及演替的認識，也為今后設計更有效的大曲發酵工藝提供了有價值的參考，對指導濃香型白酒大曲生產工藝改進具有重要的理論和實踐意義。