雙歧桿菌氧脅迫應答機制研究進展

劉亞萍，錢佳俊，鄭雯清，易文濤，王世杰，楊 玲，艾連中，熊智強*

1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海食品微生物工程研究中心，上海 200093;2.河北科技大學食品與生物學院，河北 石家莊 050018;3.河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊 050899

雙歧桿菌(Bifidobacterium)屬于細菌域、放線菌門、放線菌綱、放線菌目、雙歧桿菌科、雙歧桿菌屬，是一類不運動、不產孢子、不產氣和嚴格厭氧的革蘭氏陽性菌，主要存在于哺乳動物的胃腸道(GIT)及口腔等環境。由于對人體健康具有生物屏障、改善胃腸道功能和抗衰老等重要生理功能，被認為是腸道健康的指示菌[1]。然而，雙歧桿菌對氧氣具有高度敏感性，氧不完全還原的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)可引起蛋白質錯誤折疊和聚集、DNA損傷和脂質過氧化等有害影響[2]。雙歧桿菌作為一類具有重要經濟價值的益生菌，其對氧敏感是限制在食品和醫藥等領域中應用的重要因素。因此，本文在蛋白水平上綜述雙歧桿菌中參與氧化脅迫的酶、分子伴侶和調節因子，理解雙歧桿菌抗氧化脅迫機制，以期為雙歧桿菌產業化應用提供理論指導。

1 雙歧桿菌的活性氧損傷

分子氧(O2)是一種非極性小分子，可以自由跨越細胞膜，并從電子傳遞酶類暴露的還原基團接受外界電子，隨著連續加入電子產生超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)和羥自由基(OH-)等ROS[3]，其主要來源于生存環境的氧化還原反應、細胞內酶自氧化、NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)催化、其他競爭性微生物的釋放等生理過程[4]。產生的ROS通過破壞雙歧桿菌細胞膜磷脂、蛋白質、鐵依賴酶和DNA/RNA的完整性對細胞產生毒害作用，導致雙歧桿菌產生表達紊亂、代謝失調、細胞生長停滯甚至死亡等危害(圖1)。

圖1 雙歧桿菌活性氧損傷

2 雙歧桿菌氧脅迫應答機制

大腸桿菌是細菌中對氧化應激和防御機制研究最透徹的模式生物，當細胞受到外源性H2O2的脅迫時，其中OxyR和SoxRS作為ROS感應調節因子參與氧脅迫應答，激活烷基過氧化氫還原酶(Alkylhydroperoxide reductase,Ahp)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)等多種ROS清除酶，同時促進鐵吸收儲藏、Fe-S簇合成組裝，抑制Fenton反應，并啟動轉錄因子和sRNA表達，保護DNA和促進DNA損傷修復[5]。其他厭氧微生物中，乳酸菌在應答氧化脅迫時，細胞內產生超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、CAT等多種ROS清除酶[6,7]；巰基-二硫鍵氧化還原系統催化蛋白質二硫鍵/二巰基電子交換向巰基依賴酶類提供電子保持蛋白活性；GroEL、Hsp20、Clp和DanK等伴侶蛋白參與防止蛋白質變性、聚集和錯誤折疊過程[8]。

相比大腸桿菌和乳酸菌，在雙歧桿菌基因組中未發現OxyR和SoxRS編碼基因，但含有鐵攝取調節因子Fur編碼基因，然而對短雙歧桿菌UCC2003鐵調節研究中證實Fur不參與氧脅迫應答[9]。此外，雙歧桿菌基因組中也沒有編碼谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase,GR)、CAT和SOD等常見的ROS清除酶類基因[10]。因此，大腸桿菌和乳酸菌的抗氧化脅迫機制并不適用于雙歧桿菌，需探尋雙歧桿菌ROS清除途徑機制。對雙歧桿菌生理、生化和組學分析發現，雙歧桿菌氧脅迫應答呈現復雜且相互作用的網絡。例如，ZOMER等在短雙歧桿菌UCC2003中建立主要由clgR、lexA、hrcA和hspR等因子調控的氧化應激網絡模型[11]。在雙歧桿菌有氧培養過程中產生的Ahp是內源性H2O2的主要清除劑[12]；SATOH證實雙歧桿菌中存在TrxR-AhpC系統，保護雙歧桿菌免受氧化應激[13]；NOX和氧依賴性輔卟啉原III氧化酶(coproporphyrinogen III oxidase,HemN)參與動物雙歧桿菌中對O2或H2O2的解毒[14]。分子伴侶和蛋白酶在氧化應激中起著關鍵作用，抑制由應激引起的蛋白質變性、聚集和錯誤折疊，保護多種蛋白質免受氧化損傷[15]。HUANG等從百歲老人糞便中篩出一株具有較強抗氧化的長雙歧桿菌LTBL16，通過分析其基因組發現3個過氧化物酶(LTBL-000027、LTBL-000028和LTBL-000976)和1個NOX編碼基因(LTBL-001911)，能改善抗氧化酶FoxO依賴性轉錄，降低細胞中ROS水平，這些基因的豐度可能與ROS清除率和耐氧有關[16]。MOZZETTI等利用固定化細胞技術培養雙歧桿菌，篩選出一株適應過氧化氫的長雙歧桿菌NCC2705-HPR2，與原始菌株相比存在兩個參與跨膜運輸的編碼基因BL1404和BL0931，闡明其存在有助于提高雙歧桿菌對氧化應激抗性[17]。

2.1 NAD(P)H氧化酶

NOX是產生ROS的主要來源，可將進入細胞的氧氣進行氧化還原(圖2)，產生O2-和H2O2[18]。乳酸菌中CAT可將H2O2還原為H2O[19]，但雙歧桿菌中沒有CAT編碼基因。氧敏感型雙歧桿菌中，表現出較高的NOX活性，耐氧型雙歧桿菌則表現出極低的NOX活性[10]。在嬰兒雙歧桿菌中敲除nox可降低H2O2生成，減輕菌株對O2的敏感性[20]。因此，NOX是影響雙歧桿菌氧脅迫耐受能力的重要因素。

2.2 硫氧還蛋白系統(Thioredoxin system,TrxR)

細菌通常利用Ahp兩個亞基AhpF和AhpC還原細胞內過氧化物底物，來緩解細胞抗氧化壓力[21]。在雙歧桿菌中不含有AhpF，但含有AhpC和TrxR編碼基因。TrxR是NAD(P)H依賴性二硫化物還原酶系統，負責多種過氧化物酶包括谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,Gpx)和AhpC的還原，發揮調節細胞內氧化還原狀態的平衡。TrxR與AhpC相互作用構成TrxR-AhpC通路，保護雙歧桿菌免受氧化應激(圖2)。SATOH等從一株氧敏感雙歧桿菌JCM1255T在有氧環境下的NOX活性組分中純化得TrxR，證實TrxR-AhpC通路對氧化應激產生的H2O2進行降解，闡明其在雙歧桿菌氧化脅迫應激中的調控作用[13]。雙歧桿菌中含有類似于TrxR的TrxB(Thioredoxin reductase-like protein)，與大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中的AhpF具有同源性，且過表達AhpC時TrxB的表達量也顯著上調，表明TrxB受AhpC的反饋調節[12]。

2.3 保護鐵硫蛋白(iron-sulfur proteins,Fe/S protein)

O2可通過Fenton反應直接攻擊[Fe-S]酶中的鐵離子(圖2)，氧化釋放出鐵離子導致酶失活，同時產生的OH-繼續攻擊細胞膜中的不飽和脂肪酸，導致DNA損傷斷裂，影響細胞的代謝與生長[22]。在大腸桿菌氧化脅迫機制中，H2O2激活OxyR和PerR轉錄調控以清除ROS、保護DNA、減少氧化毒性[23,24]。Fur可調控鐵吸收，DNA結合類鐵蛋白(Dps)清除游離鐵以抑制Fenton反應[25]，鐵硫簇組裝蛋白(Suf家族)促進Fe-S簇蛋白合成[26]。盡管在雙歧桿菌基因組中未發現OxyR和PerR編碼基因，但含有fur、dps和sufBCD編碼基因，可參與到Fe-S簇蛋白合成和保護，進而清除細胞內OH-，減輕ROS對雙歧桿菌的損傷。

圖2 雙歧桿菌活性氧代謝途徑

2.4 分子伴侶

2.5 調節因子

調節因子通過控制靶基因的轉錄表達，在雙歧桿菌抗氧化脅迫應激中起到調控作用(表1)。例如，Dps參與羥自由基清除的調控[10]，非特異性結合DNA，防止DNA降解，通過結合氧化鐵抑制Fenton反應產生OH-[28]。氧化脅迫可觸發雙歧桿菌的SOS響應，RecA和LexA是主要調節因子。正常生長條件下，SOS受LexA的抑制調控，氧化脅迫時DNA損傷導致復制區單鏈DNA積累，激活RecA使LexA解離并激活SOS中recA、recX和clgR等修復基因的表達[29]。

表1 雙歧桿菌氧耐受相關的伴侶蛋白和調節因子

3 展望

雙歧桿菌作為具有代表性和重要經濟價值的益生菌，厭氧特性是影響其在工業應用的重要限制因素。因此，解析雙歧桿菌氧脅迫應答機制并提高氧化脅迫耐受性是雙歧桿菌工業化瓶頸的關鍵。通常提高雙歧桿菌抗氧化脅迫方法包括添加保護劑、包埋法、與其他乳酸菌共培養和適應性訓化。分子生物學研究發現雙歧桿菌缺少ROS調節因子和清除酶等基因，導致氧化脅迫響應機制與其他厭氧細菌具有明顯差異。本文在蛋白層面上總結雙歧桿菌中參與氧脅迫響應的酶、分子伴侶和調節因子及其應答，未來可結合基因組、轉錄組和代謝組等多組學方法對雙歧桿菌氧脅迫響應中關鍵基因和代謝物進行功能鑒定，為深入解析雙歧桿菌抗氧脅迫機制提供依據。

近年來IncRNA、miRNA和sRNA等非編碼RNA被大量研究[32]，在調控細胞凋亡和物質代謝等重要生理活動中起到關鍵作用。例如，大腸桿菌中存在sRNA SorX抑制調控多胺轉運體的一個亞基的potAmRNA，降低亞精胺攝取，提高對單線態氧(Singlet oxygen)和氫過氧化物(Hydroperoxide)的敏感性，減輕氧化損傷[33]。雖然細菌抗逆相關的非編碼RNA已有較多報道，但雙歧桿菌非編碼RNA研究尚處于起步階段，對其開展生理功能鑒定和分子機制解析等研究，有望為系統闡釋雙歧桿菌氧脅迫應答提供新的方向。