高效降解菌Arthrobacter nicotianae ZAF-05對土霉素的減毒效應

朱蓉蓉，張 贊，史艷可，林 輝，張 昕

（1. 浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 杭州 311300；2. 浙江省農業科學研究院，浙江 杭州 310021）

抗生素因其廣譜的抗菌特性和促進生長作用廣泛應用于醫療衛生、畜牧及水產養殖等領域[1]。然而，進入機體的抗生素僅有小部分發揮作用，剩下約30%～90%會隨著代謝排出體外[2-4]，并且以原藥的形式輸入周邊環境[5]。一些化學性質穩定的抗生素會在環境中長期殘留，不僅對周邊植物[6]、魚類[7]造成不利影響，其產生的選擇壓力還能夠誘導耐藥菌群的出現和抗性基因的傳播[8]。鑒于其巨大的風險和威脅，抗生素以及抗性基因已經被世界衛生組織列為21世紀最重要的污染源之一。殘留抗生素的去除和抗生素污染環境的修復成為保障生態安全和生命健康的重要舉措。殘留抗生素的去除主要有理化處理和生物降解2種途徑，其中生物降解因為價格低廉、操作簡便且不會造成二次污染而備受青睞[9]。當前關于利用微生物進行抗生素生物降解的研究日益增多，并已積累不少優良的菌種資源[10-11]。但抗生素被降解并不能確保轉化產物的安全性，一些原藥被代謝后可能會產生毒性更高的中間產物[12]。因此對降解菌株代謝產物的生物毒性評估和生態安全性評價是菌株能夠實際應用的必要保證。土霉素(oxytetracycline，OTC)是當今應用范圍最廣、用量最多的抗生素之一[13]，由于性狀穩定已在陸地、水體等多種環境中被高頻次檢出[14-15]。本研究前期分離獲得1株OTC高效降解菌Arthrobacter nicotianaeZAF-05，該菌株環境適應性好，能在液體體系、糞肥和土壤中發揮積極的降解作用[16]。本研究以該菌株為實驗對象，利用高效液相色譜-電噴霧質譜聯用技術(HPLC-Q-TOF-MS)初步解析菌株作用下OTC的降解產物，并以對OTC敏感的大腸埃希菌Escherichia coli、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis和水生生物斜生柵藻Scenedesmus obliquus作為指示生物，評估OTC降解產物的生物毒性，以期為菌株的安全使用提供初步理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株和藻種

OTC高效降解菌A. nicotianaeZAF-05于2019年分離自制藥廠活性污泥。OTC敏感菌革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌No 1.821、革蘭氏陰性菌大腸埃希菌No 1.128 82均來自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，OTC敏感斜生柵藻購自上海光宇生物技術有限公司。

1.2 培養基和試劑

OTC購于Solarbio公司，純度＞99%。LB培養基用于細菌的培養，主要配方為胰蛋白胨10 g·L-1；酵母提取物5 g·L-1；氯化鈉5 g·L-1，pH 7.2。BG11合成培養基用于供試斜生柵藻的培養，購自上海光宇生物技術有限公司并按說明書指導方法使用。質譜所用甲醇和乙腈等相關試劑均購自Merck公司(Kenilworth, 美國)。

1.3 方法

1.3.1 OTC降解產物分析 制備不同密度降解菌菌懸液，繪制細胞數量與懸液600 nm波長下吸光度[D(600)]的標準曲線，根據標準曲線得到合適密度的細菌懸液。在OTC終質量濃度為100 mg·L-1的LB培養基中接入終密度為1.5×105CFU·mL-1的降解菌。培養2 d后，取樣菌懸液經過濾除菌、過柱萃取后利用HPLC-Q-TOF-MS技術檢測OTC降解產物。質譜數據由Agilent 6 545 Q-TOF質譜儀獲得，使用電噴霧電離源，以正離子和負離子模式工作。具體工作條件：離子化壓力3 500 V，裂解電壓75 V，碰撞能30 eV，質荷比50～1 200。篩選獲得可能的轉化產物以TPs表示。以添加OTC但不接種降解菌的處理為陽性對照，以不添加OTC但接種降解菌的處理為陰性對照，所有處理均設置3個平行。

1.3.2 OTC降解產物的生物毒性分析 降解產物毒性測定設置4個處理。對照A(ckA)：添加300 mg·L-1OTC的LB液體培養基。T1處理：添加300 mg·L-1OTC的LB培養基，接種降解菌；培養4 d后20 000 r·min-1高速離心2 min，取過濾除菌后的上清備用。T2處理：添加300 mg·L-1OTC的LB液體培養基，自然降解4 d。對照B(ckB)：LB液體培養基。①OTC降解產物對細菌的生物毒性。取2組各4支試管，按1∶1(v/v)加入LB培養液和上述4個處理樣品，定容至體積5 mL。分別依次接入1.5×105CFU·mL-1的枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌新鮮菌懸液，菌液密度確定方法同1.3.1。37 ℃下震蕩培養，每隔24 h取樣測定菌液吸光度[D(600)]，用以表征細菌數量。②OTC降解產物對供試藻的生物毒性。取1組4個三角瓶，依次加入16 mL BG11培養基和2 mL上述4個處理樣品，混勻后接種終密度為1.2×103個·mL-1新鮮藻種。于25 ℃、12 h (光照) /12 h (黑暗)光周期條件下靜置培養，每天定時搖晃4～5次，每隔24 h取樣測定吸光度[D(680)]。培養4 d后取樣藻液，參考武鵬鵬等[17]的方法測定藻液葉綠素質量濃度，參考鄒寧等[18]的方法觀察藻細胞結構。

1.3.3 數據分析 各處理均3個平行，所得數據利用SPSS 16.0進行方差分析，在0.01水平下確認差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 OTC降解產物分析

OTC降解產物的生物毒性既取決于殘留的OTC，也取決于降解過程中產生的中間代謝產物。培養2 d后，對各處理懸液產物進行HPLC-Q-TOF-MS分析發現：降解菌組和陽性對照中均檢出了TP447和TP461，陰性對照中則未檢出；推測TP447和TP461可能為OTC降解相關中間產物。圖1 A和圖1 B可見：在7.279 min時TP447出現了明顯的特征峰，其圖譜特征以及出峰時間與QI等[19]發現的脫甲基OTC一致；由圖1 C和圖1 D可見：TP447在正、負離子作用下均出現了脫甲基OTC特有的離子碎片圖譜，推測TP447可能是OTC水解產物——脫甲基OTC。TP461在4～7 min區段內出現了多個特征峰(圖 2 A)，參考文獻 [20]可知：OTC出峰時間在 5.434 min時，差向異構 OTC(epioxytetracycline，EOTC)出峰時間在4.893 min時，同分異構OTC(isomeric oxytetracyline，ISO-OTC)出峰時間在6.550 min時；此3個化合物出峰時間、質荷比和分子離子峰圖譜與TP461相同，推測TP461可能為OTC(圖2 B)、EOTC (圖2 C)和ISO-OTC (圖2 D)的混合物。由表1可知：降解菌培養體系中OTC、EOTC和脫甲基OTC相對豐度極顯著低于陽性對照(P＜0.01)，表明菌株ZAF-05在加速OTC分解的同時，還可能抑制了OTC向脫甲基OTC和EOTC的轉化，使得體系中EOTC和脫甲基OTC豐度降低。

圖1 TP447的色譜和質譜圖Figure 1 Extracted ion chromatograms and mass spectrum of TP447

圖2 TP461的色譜和質譜圖Figure 2 Extracted ion chromatograms and mass spectrum of TP461

表1 OTC及其推定代謝產物的相對豐度Table 1 Relative abundance of OTC and the putative degradation products

2.2 OTC及其降解產物對細菌的生物毒性

圖3顯示：72 h的培養期內，枯草芽孢桿菌在各處理中均有不同程度的生長，隨時間推移細胞數量逐漸增加。具體來看，ckB處理下枯草芽孢桿菌生長良好，不同培養時間下細胞的吸光度[D(600)]始終最大，培養72 h時達2.563。相比之下，ckA處理72 h時D(600)僅0.334，表明受試細菌的生長受到明顯抑制，極顯著低于T1處理[D(600)=2.336]和ckB(P＜0.01)。同時T2處理下吸光度一直處于較低水平[D(600)=0.424，72 h]，與T1差異極顯著(P＜0.01)。提示OTC的自然水解過程并不能明顯降低液體中OTC及其水解產物的毒性，降解菌ZAF-05能有效分解OTC，降低OTC及中間代謝產物的毒性；T1處理下細菌細胞數量與ckB最為接近，說明降解菌減輕了OTC及中間代謝產物對枯草芽孢桿菌生長的不利影響。

圖3 不同處理對枯草芽孢桿菌生長的影響Figure 3 Effects of different treatments on growth of B. subtilis

OTC的降解產物對大腸埃希菌生長的影響呈現出與枯草芽孢桿菌一致的態勢(圖4)。T2處理下，大腸埃希菌生長受阻，72 h培養期內，與ckA處理差異均不顯著，說明OTC自然水解的解毒作用甚微。T1處理下，整個培養期內大腸埃希菌細胞數量始終處于較高水平，僅次于ckB，培養后期(48～72 h)甚至超過后者，推測可能是經ZAF-05降解后，OTC中間代謝產物為細菌生長提供了額外的碳源。

圖4 不同處理對大腸埃希菌生長的影響Figure 4 Effects of different treatments on growth of E. coli

2.3 OTC及其降解產物對斜生柵藻的生物毒性

2.3.1 OTC及其降解產物對斜生柵藻生長的影響 從圖5可以看出：斜生柵藻在4個不同處理中的長勢不同，ckB處理下供試藻生長良好[D(680)＝1.064，96 h]，而ckA中培養96 h后斜生柵藻吸光度[D(680)]僅0.028，表明OTC抑制斜生柵藻生長，生理毒性較強。T1處理下，斜生柵藻細胞數量與ckB無顯著差異，遠高于T2和ckA，說明降解菌株ZAF-05有效緩解了OTC對斜生柵藻的生物毒害。培養0～48 h，T2處理的吸光度與ckA比較差異不明顯，盡管48 h后有所增加但遠不及T1，說明OTC能發生自然水解，但解毒作用有限。

圖5 不同處理對斜生柵藻生長的影響Figure 5 Effects of different treatments on growth of S. obliquus

2.3.2 OTC及其降解產物對斜生柵藻葉綠素的影響 從圖6可以看出：ckB處理下斜生柵藻葉綠素質量濃度為2.126 mg·L-1，ckA為0.193 mg·L-1。可見，OTC的存在大大降低了藻的葉綠素質量濃度。與ckA相比，T1處理一定程度上緩解了葉綠素的減少(0.555 mg·L-1)，但仍極顯著低于ckB(P＜0.01)。結合圖5認為：盡管T1與ckB的藻類細胞數量相差不大，但其葉綠素質量濃度卻顯著降低，說明盡管降解菌ZAF-05能高效降解OTC，但短期(96 h)內，仍不能完全轉化毒性物質，培養體系中殘留的毒性可能會影響斜生柵藻的葉綠素合成。

圖6 不同處理對斜生柵藻葉綠素的影響Figure 6 Effects of different treatments on chlorophyll content of S.obliquus

2.3.3 OTC及其降解產物對斜生柵藻亞細胞結構的影響 將斜生柵藻置于電鏡下放大12 000倍觀察細胞超微結構，由圖7可見：ckB處理下斜生柵藻細胞截面為典型的橢圓形，細胞壁邊緣整齊，細胞器界限清晰，葉綠體數量多，幾乎布滿整個細胞，平行排列的類囊體整齊地堆疊在葉綠體內。在葉綠體片層間的基質中可見電子密度較大的淀粉粒，淀粉粒數目較多(圖7A)。相比之下ckA(圖7B)和T2處理(圖C)中的細胞壁邊緣不整齊，略有缺刻，葉綠體數量少，且結構松散甚至破裂變形。葉綠體中基粒類囊體片層結構減少，形態模糊不清，且排列無序無方向。T1處理下(圖7D)，斜生柵藻細胞葉綠體少于ckB，但結構仍然完整，整齊地分布在細胞壁周圍，類囊體的片層結構清晰可見且平行排列整齊，細胞結構完整無明顯損傷。以上結果證明：與T2和ckA相比，T1處理對斜生柵藻的亞細胞結構影響更小，再次證明降解菌ZAF-05能夠有效降解并降低OTC的生物毒性。

圖7 不同處理下斜生柵藻的亞細胞形態Figure 7 Effects of different treatments on chlorophyll content of S. obliquus

3 結論與討論

A. nicotianaeZAF-05是實驗室前期分離獲得的1株OTC高效降解菌，該菌株不僅能良好降解OTC，還對四環素和金霉素具有一定的去除能力，具有廣泛的應用潛力。有些環境殘留抗生素在消解時可能會被轉化成毒性更高的中間代謝產物。如LI等[21]發現：經臭氧處理5～30 min后OTC大量分解，但產生的代謝產物比OTC的生物毒性更高，其生態危害也更大。因此明確降解菌株的代謝產物生物毒性是菌株能實際發揮作用的前提和保障。本研究采用HPLC-Q-TOF-MS技術解析了OTC的降解產物，最終獲得脫甲基OTC、EOTC和ISO-OTC 3種代謝中間產物，其中脫甲基OTC和EOTC為自然水解產物，在降解菌體系和對照中均有出現，但對照中相對豐度遠高于降解菌處理體系。研究[22-23]表明：四環素類抗生素的差向異構體，往往具有比母體化合物更高的毒性，而OTC水解形成的ISO-OTC毒性卻較OTC及其衍生物(如EOTC)要小得多[23]。本研究中，對照中EOTC相對豐度為降解菌體系的4倍，而ISO-OTC在降解菌體系的相對豐度略高于對照，因此推測A. nicotianaeZAF-05促進了OTC及其高毒代謝產物EOTC向低毒物質(如ISO-OTC)的轉化，降低了體系生物毒性。

本研究以大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和模式藻斜生柵藻為靶標生物，考察了OTC及其降解產物對供試細菌和藻類的影響。結果表明：OTC不僅抑制細菌和供試藻增殖，還導致藻細胞變形，引起葉綠體片層結構破裂，與同屬四環素族的金霉素的細胞毒性表現一致[24]。OTC被降解后，細菌和藻細胞生長的抑制作用減輕，藻葉綠素合成和葉綠體超微結構的傷害作用緩解。說明降解菌ZAF-05促進體系中OTC及其高毒代謝產物EOTC向低毒物質轉化，從而降低了生物毒性。

葉綠體是藻進行光合作用的重要細胞器，內部密布排列整齊的基粒內囊體，基粒內囊體既是葉綠素也是光合系統存在的場所，光合作用過程中的光反應在此進行[25-26]，因此基粒類囊體結構的完整性和有序性是葉綠體進行正常、高效的光能轉換的首要前提，對于保障光合作用的順利進行具有重要意義。本研究中OTC的存在破壞了藻細胞葉綠體中基粒內囊體片層結構的完整，影響了光合作用。這可能是OTC導致藻細胞數量減少的一個重要原因。而添加菌株ZAF-05后，藻內葉綠體仍整齊地分布在細胞壁周圍，類囊體片層結構清晰可見且平行排列整齊，細胞結構完整無明顯損傷，再一次證實，ZAF-05的降解作用能降低OTC的生物毒性，提高其生態安全性。