3種竹子內生固氮菌特征及多樣性

馮歌林，高 競，嚴淑嫻，王 晶，梁辰飛，秦 華，陳俊輝，徐秋芳

（1. 浙江農林大學 環境與資源學院，浙江 杭州 311300；2. 浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300）

植物內生固氮菌是指定殖在健康植物體內、與宿主植物進行聯合固氮活動的一類原核微生物，是植物微生態系統的天然組分[1]。研究發現[2]：因為存在固氮菌，某些亞熱帶地區稻田可以連續百年不施氮肥而土壤氮水平不下降。固氮微生物一般分為3類：自生固氮菌、與植物共生固氮的微生物、與植物聯合固氮的微生物。共生固氮微生物常見于豆科Leguminosae植物中[3]，其固氮機制、菌肥開發等研究已相當成熟。聯合固氮微生物最早由D?BEREINER[4]從熱帶禾木科Gramineae牧草雀裨Paspalum thunbergii根際中分離獲得，這種被命名為雀裨固氮菌Azotobacter paspali的微生物被認為是存在于根際的自由生活的固氮菌。它們可以部分入侵植物表層組織，依靠根系分泌物生存繁殖，不與宿主形成特異分化結構，因而固氮能力不及共生固氮菌，但這類固氮菌與植物關系密切。BARRAQUIO等[5]通過建立有效的水稻Oryza sativa內生固氮菌分離方法，測得水稻內生固氮菌數量為105～108CFU·g-1；袁梅等[6]從湖南桂陽農田水稻分離出19株內生固氮菌，其中13株可抑制水稻苗期對鎘的吸收；譚志遠等[7]從青香茅Cymbopogon caesius與五節芒Miscanthus floridulus中分離出66株內生固氮菌共10個類群；BALDANI等[8]發現玉米Zea mays莖內存在內生固氮菌肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae，后者具有促進植物生長的作用。作為同屬禾本科的木本植物，竹子內生固氮菌的報道較少。竹子是喜氮植物，對氮素要求較高；調查發現許多自然竹林沒有氮肥補充但生長良好，提示竹子可能存在某種固氮菌，且后者具有較強的固氮潛能。顧小平等[9]從浙江淡竹Phyllostachys glauca根際分離到3株活性較高的固氮菌，從毛竹Phyllostachys edulis根表面分離到36株固氮菌，分別為多黏芽孢桿菌Bacillus polymyxa和地衣芽孢桿菌Baclicus lincheniformis[10]；侯偉等[11]從簕竹Bambusa blumeana中分離到40株高效固氮酶活性菌株，分別屬固氮螺菌屬Azosprillum、大腸埃希氏菌屬Escherichias、綠膿桿菌屬Pseudomonas和水螺旋菌屬Aquaspirillum；同時從簕竹[12]中分離到5株內生固氮菌，具有活性高、生長強勢、可以通過自身代謝作用來適應環境酸堿性變化等特征。目前，國內關于竹子內生固氮菌的研究甚少。本研究以毛竹 (散生)、孝順竹Bambusa multiplex(叢生)和狹葉青苦竹Pleioblastus chino(混生)為研究對象，利用分子生物技術研究不同生長型竹子根部及葉部的內生固氮菌、定殖土壤固氮菌的多樣性和結構特征，探究不同竹種和不同器官間內生固氮菌多樣性，探討植株與定殖土壤內固氮菌多樣性的關系，為竹子培育管理提供指導，也為開發有潛力的高效固氮菌，減少化學氮肥施用量、解決因化肥使用過度所造成的環境污染問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

狹葉青苦竹、孝順竹栽植于浙江農林大學竹種園內，毛竹栽植于浙江農林大學后山。所有林相均為純林，所有土壤均為紅黃壤。采集竹葉、細根及不同竹種根部定植土壤。被選植株要求生長力旺盛，遠離邊緣地帶，未受到病蟲害感染。每種竹子選取3株間隔約15 m的不同植株作為重復。土壤樣品采自所選竹子根周，深度為0～30 cm。所有樣品放入4 ℃冰箱保存備用。

1.2 土壤基本化學性質測定

經風干、磨細、過篩后，測定土樣土壤化學性質。具體參考鮑士旦[13]的方法，測定土壤含水量、pH、有機質、有效氮、速效磷、速效鉀等指標。由表1可知：3種竹子定植土壤的pH、有機質、有效氮、速效鉀、速效磷等指標均未表現出顯著性差異(P＞0.05)，說明土壤樣品的化學性質差異不影響固氮菌種類。

表1 3 種土壤的基本化學性質Table 1 Basic chemical properties of three soil

1.3 竹子內生微生物 DNA 提取

竹子葉與根的預處理參考譚致遠等[7]方法。葉與根滅菌消毒后，剪碎放入無菌研缽。用液氮充分研磨破碎植物樣品，參考高志民等[14]改良后的CTAB法提取植物內生微生物DNA，-40 ℃冰箱保存備用。

1.4 土壤微生物 DNA 提取

土壤樣品過20目篩，按Mobio土壤微生物DNA試劑盒(Powersoil kit，美國)提取土壤微生物DNA。

1.5 固氮酶 nifH基因擴增

固氮酶nifH基因采用聚合酶鏈式反應方法 (PCR)擴增。第 1輪正向引物 FGPH19：5′-TACGGCAARGGTGGNATHG-3′，反向引物 polR：5′-ATSGCATCATYTCRCCGGA-3′；第 2 輪正向引物 AQER：5′-GACGATGTAGATYTCCTG-3′，反向引物 polF-GC：5′-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3′。擴增程序參考DIALLO等[15]。

1.6 固氮酶nifH基因的變性梯度凝膠電泳(DGGE)

使用DCodeTMUniversal Mutation Detection System (Bio-Rad，美國)對PCR產物進行變性梯度凝膠電泳，用GelDocTMEQ凝膠成像系統 (Bio-Rad，美國)拍照保存。

1.7 固氮酶 nifH基因的隨機克隆

用polF(不含GC)與AQER引物擴增各竹種葉部、根部DNA，PCR產物用純化試劑盒(Takara)純化后與pEASY-T3 Vector(全金式生物技術公司，中國，北京)連接，轉化到Trans1-T1感受態細胞中，涂在含有X-Gal、IPTG、氨芐青霉素的LB瓊脂平板上進行藍白斑篩選，用菌落PCR方法檢測陽性克隆子。陽性克隆菌液送上海生工生物技術公司進行測序，序列通過NCBI進行Blast比對分析，獲取相近典型菌株序列[16]。

1.8 數據分析

利用Quantity one軟件對DGGE電泳圖進行指紋圖譜分析，根據條帶對比結果，通過未加權算術平均法進行聚類分析；計算Shannon多樣性指數，使用SPSS軟件進行單因素方差分析與兩兩比較(Ducan法)；使用Mega 5.0，采用鄰接法進行系統發育樹分析。

2 結果與分析

2.1 不同來源固氮菌 PCR 產物

對土壤微生物、植物內生微生物DNA分別進行2輪巢氏PCR，獲得土壤和植物固氮菌的nifH基因。由圖1A和圖1B可見：400～500 bp出現了一系列較為明亮的條帶，即為目標nifH基因。

圖1 土壤固氮菌(A)與植物固氮菌(B)nifH基因擴增Figure 1 nifH gene’s PCR products of soil azotobacteria (A) and plant endophytic diazotrophs (B)

2.2 土壤固氮菌 DGGE 分析

DGGE圖譜中，條帶數量代表樣品所含固氮菌種類、多樣性的豐富程度，條帶粗細代表該種菌的生物量的大小(圖2A)。使用Quantity one軟件識別DGGE圖中條帶信息，以毛竹土壤3號為基準進行相似度分析，共識別出17個條帶，且不同土壤樣品之間出現一定數量的共有條帶。這表明不同竹子定植的土壤存在著一定數量相同種類的固氮菌。

圖2 土壤固氮菌nifH基因片段DGGE指紋圖譜(A)與聚類分析樹(B)Figure 2 The nifH gene DGGE fingerprint(A) and clustering analysis tree (B) of soil azotobacteria

聚類分析中各樣品之間的分支點數值代表植物內生固氮微生物之間親緣關系的遠近，數值越大越相似。由圖2B可知：不同竹種之間、同一竹種重復樣品間土壤固氮菌相似度不高。一般認為相似度達到0.60及以上時說明群體間相似性好[17]。本研究中孝順竹3個土壤樣品重復聚在一起，但整體相似度也僅為0.57，說明土壤中固氮菌群落的變異性較大。對于土壤微生物而言，復雜的物質組成和空間結構導致微生物的變異性增加。雖然3種土壤的理化性質沒有顯著差異(表1)，但土壤的固氮菌仍然存在較大差異。

2.3 竹子根部與葉部內生固氮菌 DGGE 分析

不同竹種、不同器官的內生固氮菌nifH基因DGGE指紋圖譜如圖3A所示。以毛竹土壤3號為參照，毛竹葉與根、狹葉青苦竹葉、孝順竹葉與根等9個樣品出現了明亮且粗大的條帶，這些條帶豐度較大，為優勢固氮菌種。研究發現[18]：不同菌在組織內占有不同生態位，它們相互作用建立一種生態平衡，分離頻率高的為植物體內數量大的優勢種群，相反則為稀有種群。圖3中，竹根的條帶數明顯多于竹葉，說明根部內生固氮菌種類多于葉部。劉麗輝等[19]發現普通野生稻Oryza rufipogon內生固氮菌在水稻根部分布最多，莖葉中偏少，呈自下而上逐級遞減規律，與本研究一致。且竹根部內生固氮菌種類遠多于土壤，說明竹子根部固氮菌不僅來源于土壤，還通過其他途徑進入植株，如KLUEPFEL等[20]認為細菌是通過植物自然開口(水孔、氣孔、皮孔和蜜腺等)和傷口(根磨損、動物攝食及收割多年植物等)進入植物體內的。

圖3 竹子葉與根內生固氮菌nifH基因DGGE指紋圖譜(A)與聚類分析樹(B)Figure 3 DGGE fingerprint of nifH gene endophytic diazotroph(A) and clustering analysis tree (B) in bamboo’s leaves and roots

聚類分析結果(圖3B)表明：不同植物樣品整體相似度不高，但大部分葉與根的樣品明顯區分，竹子葉與根分別聚在不同組，表明竹子器官差異是影響內生固氮定殖的重要因素。毛竹土壤樣品(MT3)和根部樣品聚集，但相似值僅有0.48，進一步說明了植株內生固氮菌僅有部分通過土壤進入，且大多定殖在根部，少部分擴散到葉部。以相似度大于0.60為群體間相似性很好的標準判斷[17]，同一品種同部位重復樣品間的相似度均不高，除狹葉苦青竹1號與狹葉苦青竹2相似值達0.77外，其他樣品3個重復都未能聚集，說明內生固氮菌種類與植物種類關系不大，遺傳因子沒有起到決定性作用。植物內生固氮菌的捕獲具有一定的偶然性。

2.4 不同來源固氮菌 Shannon 多樣性指數分析

以指紋圖譜信息為依據計算各個樣品的Shannon多樣性指數可以評價群落多樣性。如表2所示：狹葉青苦竹根部內生固氮菌多樣性最為豐富，顯著高于葉部與土壤(P＜0.05)。毛竹固氮菌多樣性依次為根部(2.98)、土壤(2.75)、葉部(2.30)，毛竹根部和土壤間無顯著差異，但兩者顯著大于毛竹葉部(P＜0.05)，說明土壤固氮菌與根部內生固氮菌多樣性都比葉部要豐富。孝順竹葉部、根部內生固氮菌、土壤固氮菌間多樣性差異不顯著(P＞0.05)。不同竹種不同部位固氮菌多樣性不同，狹葉青苦竹和毛竹以葉部最低，孝順竹葉部最高，這可能與竹子的生長繁殖方法有關；孝順竹為叢生竹，竹子在某一個固定位置生長更新，根部和土壤中的固氮菌容易進入葉子；毛竹為散生竹，狹葉青苦竹雖然是混合型竹子，但以散生的居多，隨著地下鞭的延伸更新，這些竹子不斷改變著生地點，其本身的固氮菌可能也少，通過地下鞭和地上部分的通道到達葉子中的固氮菌便更少。

表2 不同來源固氮菌 Shannon 多樣性分析Table 2 Shannon indexes of the three bamboos’ leaves, roots and soil

對不同竹種相同部位內生菌多樣性分析發現：孝順竹葉部內生菌多樣性顯著高于狹葉青苦竹和毛竹(P＜0.05)，根部則顯著低于狹葉青苦竹和毛竹(P＜0.05)；毛竹和孝順竹土壤固氮菌多樣性顯著高于狹葉青苦竹(P＜0.05)；說明對于毛竹與狹葉青苦竹而言，固氮菌群落更偏愛在根部定殖，對于孝順竹而言，固氮菌群落更喜愛在葉內定殖。

2.5 竹子根部與葉部內生固氮菌的隨機克隆

對不同竹種根部/葉部的內生固氮菌DNA作隨機克隆并測序(表3)，在培養基上共得到484個藍色斑點，經驗陽后送測121個，序列經BLAST數據庫對比，得到83株菌株，其中12株為可培養固氮菌，歸屬于8種菌屬，其余71株為不可培養固氮菌(來源于毛竹葉8株，毛竹根14株，孝順竹葉7株，孝順竹根14株，狹葉青苦竹葉8株，狹葉青苦竹竹根20株)，尚未被命名，不可培養的比例高達86%；推測原因可能是不可培養固氮菌在竹子內生固氮菌中處于優勢地位，也可能是竹子中某些可培養的內生固氮菌尚未在其他植物中被分離鑒定，這也進一步說明了該類固氮菌的特殊性。12株可培養的固氮菌大部分為根組織內生菌(表4)，除Immundisolibacter和紅長命菌屬Rubrivivax外，均已報道具有固氮基因[19，21-28]。8個菌屬中，慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium出現頻率最高，一般是從大豆Glycine max根部分離得到，如XU等[21]從大豆和野大豆Glycine soja根瘤中分離出了與大豆結瘤的超慢生遼寧大豆根瘤菌Bradyrhizobium liaoninggense。固氮螺菌屬Azospirillum具有明顯的固氮功能，在植物根、莖、葉中廣泛存在[19]；此外，翟超男[22]，周建嬌[23]分別從海濱雀稗Paspalum vaginatum和白菜Brassica pekinensis根發現具有固氮功能的腸桿菌Enterobactersp.；李潔瓊等[24]從玉米根際中分離出具有促生作用的Kosakonia radicincitansstrain YD4同樣具有固氮功能，而Kosakonia是從腸桿菌屬Enterobacter中分離出來的新屬。TAN等[25]通過南方雜交法與乙炔還原法發現Dechlorosoma suillum中具有nifH基因；唐凱等[26]在研究渾善達克沙地苔蘚Bryophyta結皮下層土壤細菌時發現Azohydromonas具有固氮功能。紅長命菌可以氨為氮源，是目前發現的唯一能分泌蛋白酶的光合細菌[27]，Immundisolibacter是變形桿菌的一種新細菌，具有降解多環芳香烴的功能[28]。本研究從毛竹根部和孝順竹根部鑒定出的紅長命菌和Immundisolibacter中存在固氮基因，推測此2種菌很可能是具有固氮能力的新種。

表3 基于nifH序列的不可培養固氮菌分布情況(相似度98%以上)Table 3 Distribution of unculturable bacteria based on nifH gene (The similarity is more than 98%)

表4 基于nifH序列的可培養固氮菌分布情況Table 4 Distribution of culturable bacteria of nifH gene

孫建光等[29]從小麥Triticum aestivum、水稻、白菜、玉米、芹菜Apiumsp.等5種農作物中分離到25個屬的內生固氮菌。本研究選取伯克霍爾德氏菌Burkholderiasp. strain STM678、假單胞菌Pseudomonas corrugata、芽孢桿菌Bacillus aryabhattaistrain B8W22和克雷伯氏菌Klebsiella variicola等4個優勢種作為參照，與3種竹子中篩選出的克隆序列構建系統發育樹。由圖4可見，除1株來源于狹葉青苦竹的菌株(不可培養)與伯克霍爾德氏菌聚在一起外，其他菌株均遠離參照菌株。具體來看，慢生根瘤菌屬位于發育樹中部位置，紅長命菌屬、Kosakonia、腸桿菌屬、脫氯菌屬Dechlorosoma、固氮螺菌屬親緣關系接近，Immundisolibactercernigliae位于發育樹的偏頂端位置，親緣關系遠離以上5個屬。牛艷芳[30]對內蒙古植被主要建群植物的根際固氮菌進行分離時發現：6個地區的固氮菌類群存在顯著差異，有些固氮菌分布具有區域性。推測這種大區域環境差異造成的固氮菌類群差異，可能也是竹子內生固氮菌與其他作物內生固氮菌存在較大區別的原因。

圖4 鄰接法構建的內生固氮菌序列系統發育樹Figure 4 System phylogenetic tree of endophytic diazotrophs by using neighbor-joining method

3 結論

不同竹種定植的土壤中存在著一定數量的同種固氮菌，但整體區系的相似度不高。同一竹種不同器官(根與葉)之間、不同竹種相同器官之間、土壤與植物之間的固氮菌群落結構差異顯著；同種竹葉部或根部的重復樣品相似度均不高。3種竹子根部內生固氮菌種類總體顯著多于葉部，土壤固氮菌群落結構與根部內生固氮菌相似度高于葉部；不同竹種、不同器官之間固氮菌群落Shannon多樣性指數差異顯著，孝順竹葉部與土壤大于根部，狹葉青苦竹和毛竹根部大于葉部和土壤。植物樣品隨機克隆測序BLAST對比得到83株固氮菌，其中12株為可培養固氮菌株，分別屬于慢生根瘤菌屬、Dechlorosoma、固氮螺菌屬、腸桿菌屬、Kosakonia、變形桿菌屬、紅長菌屬、Azohydromonas等8個屬，與已報道對竹子內生固氮菌研究相比，僅與侯偉等[12]從簕竹中分離得到了相同的固氮螺菌，但未發現其他相同種屬。系統發育樹結果表明3種竹子內生固氮菌顯著不同于其他植物中分離得到的內生固氮菌。