長喙毛茛澤瀉根莖葉營養成分與急性經口毒性

石從廣，李浩銘，仇建習，呂賢良，葉 珊

（1. 浙江省林業科學研究院，浙江 杭州310023；2. 麗水市蓮都區生態林業發展中心，浙江 麗水323000）

長喙毛茛澤瀉Ranalisma rostratum是澤瀉科Alismataceae毛茛澤瀉屬Ranalisma多年生蓮座狀沼生小草本植物，產于中國的浙江、江西、湖南省以及越南和馬來西亞[1]。1930年，在浙江省麗水市南明山首次采到長喙毛茛澤瀉標本[2]，之后幾十年不曾采到，一度被認為滅絕。直到20世紀90年代，研究人員才相繼在江西省東鄉縣和湖南省茶陵縣陸續發現野生長喙毛茛澤瀉種群[3]。由于人類對其生境的破壞和本身生存、競爭能力較差，湖南茶陵和江西東鄉野外長喙毛茛澤瀉種群已消失[2]。1999年，國家林業局和農業部正式發布了中華人民共和國《國家重點保護野生植物名錄(第1批)》，長喙毛茛澤瀉被列為極度瀕危的植物，為國家Ⅰ級保護野生植物[4]。2008年，浙江省人文園林有限公司天景水生植物園從杭州植物園交換引入了長喙毛茛澤瀉，并進行了大規模的遷地擴繁[5-6]。2015年，浙江省麗水市蓮都區林業技術推廣站從天景水生植物園引進長喙毛茛澤瀉5 000株，開始回歸原生地試驗。目前，在麗水市蓮都區布局了3個回歸示范點，2019年8月，每個示范點繁育長喙毛茛澤瀉小苗不少于5 000株，已初步具備了開發利用的物質基礎。目前，國內學者圍繞長喙毛茛澤瀉繁育特性與遺傳多樣性[7-8]、有性生殖系統[9-13]、生物學特性與生活史[2,14]、種群生態與環境適應性[15-19]等方面開展研究，目的是揭示其瀕危機制，為制定保護策略提供依據。但關于長喙毛茛澤瀉植株營養成分和毒性試驗的研究尚無報道。本研究測定了采自麗水3個示范點的長喙毛茛澤瀉植株莖葉和根的主要營養成分，并對莖葉的急性經口毒性進行初步研究，以期為長喙毛茛澤瀉的進一步保護利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 采樣地概況

本研究所用的長喙毛茛澤瀉植株分別來自麗水南明山、蓮都區大港頭鎮和蓮都區老竹鎮。南明山樣地處于麗水市南明山風景名勝區，長喙毛茛澤瀉被栽植在一片沼澤地中，沼澤地處于森林邊緣，森林整體郁閉度為0.5～0.7；沼澤周圍有毛竹Phyllostachys edulis、楓香Liquidambar formosana等喬灌樹種；沼澤地水位維持在2～10 cm，伴生植物有蕺菜(魚腥草)Houttuynia cordata、蕨Pteridium aquilinumvar.latiusculum、苧麻Boehmeria nivea、野芋Colocasia antiquorum等。大港頭樣地位于麗水市蓮都區大港頭鎮，長喙毛茛澤瀉被栽植在水田，伴生植物有丁香蓼Ludwigia prostrata、喜旱蓮子草Alternanthera philoxeroides等；水田呈梯田狀，有高低落差，水位常年維持在5～15 cm，且有進水出水口，水流較緩；樣地周邊無喬灌木遮陰。老竹鄉樣地位于麗水市蓮都區老竹鄉，長喙毛茛澤瀉被栽植在水田里，伴生植物有刺芋(野茨菇)Lasia spinosa、蓮Nelumbo nucifera和喜旱蓮子草等；水田坡度較為平緩，周圍缺乏喬灌木遮陰；8月蓮葉已展開，此時郁閉度接近0.9；水田水位及出水情況與大港頭樣地基本一致。

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理 2019年8月26日，每個試驗地采集1份樣品，每份樣品鮮質量為300～1 000 g。瀝干樣品表面水分，用精度為0.01 g的天平稱量植株鮮質量，之后攤放在竹篾上曝曬，待連續3 d樣品質量下降不超過1%時，認為樣品已風干。2020年6月15日，再次采集南明山示范點樣品1份，進行相同處理。

1.2.2 營養元素測定和小鼠急性經口毒性試驗 剪掉風干后的長喙毛茛澤瀉樣品根系，將莖葉與根系分離，用精度為0.01 g的天平稱量莖葉質量和根系質量，計算干鮮比和莖葉與根系生物量比，然后進一步檢測風干樣品莖葉和根的脂肪、氮、磷、鉀和其他金屬離子質量分數。每份樣品每個指標重復測定3次。

將經營養元素測定后剩余樣品的干燥莖葉用于小鼠急性經口毒性試驗。稱取干燥的莖葉35.00 g，用小型干磨研磨機在常溫下(25 ℃)粉碎30 s，待無明顯莖葉殘渣時停止粉碎，刮取莖葉粉末，過 20目篩，去除未充分粉碎的顆粒，得到綠色均勻粉末狀樣品。稱取上述粉末樣品10 g，以質量分數1%羧甲基纖維素鈉為溶媒溶解配制成80 mL懸浮樣液。每個樣品共配制這樣的懸浮樣液3瓶，每瓶80 mL，4 ℃冰箱冷藏備用。

小鼠急性經口毒性試驗委托浙江省醫學科學院完成。實驗用小鼠Mus musculus由浙江省實驗動物中心提供，SPF級，實驗動物生產許可證號為SCXK(浙)2019-0002，實驗動物使用許可證號為SYXK(浙)2019-0011，實驗動物飼料由浙江省實驗動物中心提供。實驗所用小型干磨研磨機型號為TY-150A，由永康市敬業工貿有限公司生產。實驗用天平型號為BS2202S，量程2.0 kg，由賽多利斯(北京)科學儀器有限公司生產。檢測環境條件：溫度為20～25 ℃，相對濕度為40%～70%。

1.3 測定方法和依據

1.3.1 營養成分與金屬元素測定 長喙毛茛澤瀉樣品植株中脂肪、全氮、全磷和6種金屬元素質量分數的測定委托浙江方圓檢測集團股份有限公司檢測，其中脂肪質量分數依據GB 5009.6-2016《食品安全國家標準：食品中脂肪的測定》測定；莖葉和根中全氮質量分數的測定參照HJ 717-2014《土壤質量 全氮的測定 凱氏法》測定，全磷質量分數的測定參照NYT 88-1988《土壤全磷測定法》測定；鉀、鈣、鎂、鐵、錳和鋅質量分數依據GB 5009.268-2016《食品安全國家標準：食品中多元素的測定》測定。

1.3.2 小鼠急性經口毒性試驗 ①實驗動物：選用健康、成熟，體質量18～22 g(美國癌癥研究所分送)小鼠20只，雌雄小鼠各10只。②劑量和給藥方法：按限量法設7.5 g·kg-1(體質量)1個劑量組。灌胃前小鼠禁食(禁水)6 h后，用懸浮樣液按20 mL·kg-1灌胃容量對小鼠進行灌胃，共計3次，每次間隔4 h，末次灌胃2 h后小鼠自由進食、飲水。③觀察指標：灌胃后，觀察小鼠的一般狀況、中毒表現和死亡情況，觀察期限為14 d，記錄小鼠實驗期初及期末體質量。

2 結果與分析

2.1 不同樣品的干鮮比和莖葉與根的生物量比

由表1可知：長喙毛茛澤瀉的干鮮比為0.17～0.19，整個植株，特別是莖葉部分的含水率較高。長喙毛茛澤瀉莖葉與根的生物量之比為1.8～2.5，不同取樣時間和取樣地，莖葉與根的生物量之比相差很大，其中南明山2號樣品和大港頭鎮樣品的莖葉與根的生物量之比高于其余2個樣地，特別是南明山2號樣品。對表1的結果分析發現：未結實的長喙毛茛澤瀉植株，其莖葉與根的生物量之比相較已結實的植株要高，莖葉生物量占整個植株的比例大。主要原因在于不同采樣時期植株的成熟度和植株長勢不一樣，南明山2號采集時間為2020年6月中旬，長喙毛茛澤瀉還未開花，此時植株生長比較旺盛；而大港頭鎮、南明山1號和老竹鄉樣品的采集時間為2019年8月，此時3個樣品均已結實，植株長勢開始衰敗。

表1 長喙毛茛澤瀉3個樣地4份樣品的干鮮比和生物量Table 1 Dry-fresh ratio and biomass of 4 batches of R. rostratum from 3 samples places

2.2 植株脂肪和營養元素質量分數變異特征

由表2可知：長喙毛茛澤瀉植株中脂肪、氮和鉀質量分數均為25.00 mg·g-1左右，脂肪質量分數的最大最小值之比小于5，且變異系數為39.86%，說明脂肪在不同樣品和植株器官間變異不大。營養元素平均質量分數大于10.00 mg·g-1的有氮和鉀，平均質量分數為5.00～10.00 mg·g-1的有鐵和鈣，平均質量分為1.00～5.00 mg·g-1的有磷和鎂，平均質量分數小于1.00 mg·g-1的有錳和鋅。鋅與大量元素氮和鉀的平均質量分數相差了近3個數量級。各營養元素質量分數均值從高到低依次為氮、鉀、鐵、鈣、磷、鎂、錳、鋅。

與世界陸生維管植物元素平均質量分數范圍相比較[20]，麗水3個回歸示范點4份長喙毛茛澤瀉樣品的氮、磷、鉀、鈣、鎂這5種大量必需營養元素質量分數均在正常范圍內(表2)。但與陸生高等植物所需元素的適合平均質量分數值相比較[21]，該5種元素的質量分數，除鎂外，氮、磷、鉀和鈣均高于已報道的陸生高等植物所需元素的相應組織，這可能與長喙毛茛澤瀉為水生草本植物有關。從變異系數來看，8種營養元素從大到小依次為鐵、鎂、磷、錳、鈣、鉀、鋅、氮，鐵質量分數在各樣品和組織間變異系數最大，其次是鎂和磷，說明鐵、鎂和磷在各樣地和植株器官間質量分數不穩定，受樣地環境影響較大。氮質量分數在各樣品和植株器官間變異系數最小，說明氮在植株體內相對穩定。從元素質量分數的最大值與最小值之比(以下簡稱最大最小比)來看，鎂的最大，其次是鐵，再次是磷，其他元素均小于5.00，最大最小比從大到小的順序與變異系數的順序基本一致，進一步說明長喙毛茛澤瀉中的鎂、鐵和磷質量分數不夠穩定，而其他元素均較穩定。

由圖1可知：南明山1號樣品的脂肪質量分數最高，老竹鄉樣品中的脂肪質量分數最低，脂肪質量分數在4個樣品之間存在顯著差異(P＜0.05)。7種營養元素在樣品內和各樣品間的變異系數很大。鐵質量分數在大港頭鎮樣品中最高，而在南明山2號樣品中的最低，兩者均值相差30倍左右，但鐵質量分數在4個樣品中卻無顯著差異；鎂質量分數均值在南明山1號樣品中低于檢測限(＜0.003 mg·g-1)，而在其他各樣品中平均質量分數均在1.00 mg·g-1以上；由于鋅質量分數極低，鋅元素質量分數不納入樣品和器官的比較分析。除了未做分析的鋅，7種營養元素在4個樣品間均無顯著差異。

圖1 4個樣品莖葉和根的脂肪及營養元素平均質量分數Figure 1 Average contents of fatty acid and nutrient elements in the stems，leaf and root of the four samples

由表3可見：脂肪質量分數在長喙毛茛澤瀉的莖葉和根之間無顯著差異，氮、磷、鉀和鈣在莖葉和根間存在顯著差異(P＜0.05)，說明長喙毛茛澤瀉根系對這些元素具有選擇吸附性；鐵元素在莖葉和根的平均質量分數(分別為1.22和11.75 mg·g-1)雖相差了1個數量級，但莖葉和根間卻并無顯著差異，原因在于鐵質量分數在個別樣品(大港鎮)的根系中極高，在不同樣品的不同組織之間變異極大(變異系數為123.67)，導致了方差勻齊度很低。這也說明長喙毛茛澤瀉根系對土壤中的鐵離子有富集作用。根系中的錳和鎂元素在質量分數高于莖葉中的，但在莖葉和根之間差異不顯著(P＞0.05)，表明這2種元素在莖葉和根之間沒有明顯的分布傾向性。

表3 長喙毛茛澤瀉莖葉與根系的脂肪和營養元素均值及顯著性分析Table 3 Mean value and significance analysis of fat and nutrient elements in stem, leaf and root

2.3 長喙毛茛澤瀉植株脂肪和營養元素的相關性分析

由表4可見：脂肪和營養元素質量分數之間的相關系數在較大范圍內波動，說明不同元素之間的相互關系較為復雜。分析脂肪和8種營養元素的36對因子的相關關系可知：7對因子間存在顯著相關性，如鉀與氮，磷與氮、鉀，鈣與氮、鉀、磷，鎂與磷，占總對數的19.44%。其中，氮與鉀、鈣呈極顯著正相關(P＜0.01)，與磷呈極顯著負相關；鉀與磷呈極顯著負相關(P＜0.01)，與鈣呈顯著正相關(P＜0.05)；磷與鈣呈顯著負相關(P＜0.05)，與鎂呈顯著正相關(P＜0.05)。這些結果說明：長喙毛茛澤瀉的氮、鉀、鈣之間存在協同作用，與磷存在拮抗作用；鎂與磷存在協同作用。

表4 長喙毛茛澤瀉植株脂肪和8種營養元素間相互關系Table 4 Correlation between plant fat and 8 nutrient elements

2.4 小鼠急性經口毒性試驗

如表5所示：實驗期間，小鼠均未出現中毒表現，無死亡。長喙毛茛澤瀉葉片對雌雄小鼠經口半致死量(LD50)均大于7.5 g·kg-1(體質量)，按急性毒性分級標準判定，屬實際無毒級。

表5 長喙毛茛澤瀉莖葉的小鼠急性經口毒性試驗結果Table 5 Acute oral toxicity test in mice of leaf of R. rostratum

3 結論與討論

長喙毛茛澤瀉為水生小草本植物，其葉片為紙質。根據干鮮比結果推測植株自由水含水率在81%以上，顯示植株含水率較高。長喙毛茛澤瀉植株中脂肪平均質量分數略高于23.13 mg·g-1，且在不同樣品間和植株器官間變異不大，進一步的方差分析顯示脂肪質量分數在莖葉和根之間差異不顯著，但在不同樣品間存在顯著差異。

長喙毛茛澤瀉植株的8種營養元素質量分數顯示：5種大量營養元素質量分數均值從高到低依次為氮、鉀、鈣、磷、鎂。從變異系數和各營養元素質量分數的最大值與最小值之比來看，長喙毛茛澤瀉中的鎂、鐵和磷在不同樣地和植株器官間不穩定，受樣地環境影響較大，而其他元素均較穩定。進一步的方差分析顯示：除鋅外，其余7種營養元素質量分數在4個樣品間均無顯著差異，但氮、磷、鉀和鈣在莖葉和根間差異顯著，說明長喙毛茛澤瀉根系對這4種元素具有選擇吸附性。對長喙毛茛澤瀉不同樣品和組織中營養元素質量分數的相關分析顯示：氮、鉀、鈣這3種元素兩兩之間存在顯著或極顯著正相關，而與磷存在顯著或極顯著負相關，磷與鎂存在顯著正相關。

長喙毛茛澤瀉莖葉的小鼠經口急性毒性試驗表明：雌雄小鼠半致死質量分數均大于7.5 g·kg-1，試驗期間各組小鼠均未出現死亡情況。按急性毒性分級標準判定，該樣品屬實際無毒級。

植物元素特征除與植物本身的遺傳學特性有關外，主要受土壤和氣候等生境條件的影響，也是植物對所在生境長期適應的結果[22]。羅緒強等[23]對雷公山自然保護區5種常見木本植物葉片的6種大量必需營養元素進行了測定分析。結果表明：6種元素質量分數從高到低依次為氮、鈣、鉀、硫、鎂、磷；惠岑懌等[24]的研究顯示：4種旱生針茅屬Stipa植物葉片中7種大量元素質量分數均值從高到低依次為碳、氮、鉀、硫、鎂、磷、鈣。這些大量元素質量分數的排序結果與本研究結果有所不同，可能的原因是本研究的研究對象為水生草本植物，而上述2篇文獻的研究對象分別為陸生木本植物和旱生草本植物。

對陸地生態系統的高等植物而言，當氮磷比＞16時，說明植物生長受到磷的限制，當氮磷比＜14時，植物生長受到氮的限制，而當氮磷比為14～16時，氮與磷單獨或共同影響植物的生長[25]。長喙毛茛澤瀉的氮磷比在4個樣品和不同器官間均小于14，說明其生長受到氮的限制。此外，羅緒強等[23]的文獻結果顯示：氮和磷、氮和鉀、磷和鈣、鉀和鈣質量分數之間均具有顯著或極顯著正相關關系。惠岑懌等[24]的研究結果顯示：非金屬元素碳、氮、硫、磷 等與金屬元素鉀之間顯著正相關，與其他金屬元素顯著負相關。本研究結果表明：氮和鉀、鉀和鈣質量分數間存在極顯著和顯著正相關，但磷與金屬元素鉀、鈣、鎂質量分數的相關性與其他文獻的結果有明顯的不同，說明不同植物體內這些元素之間具有不同的比例組成和協調關系。

石從廣等[26]對越南安息香Styrax tonkinesis精煉的種子油開展了大小鼠急性經口毒性試驗以及慢性毒性3項試驗。結果發現：精煉油對應的小鼠半致死質量分數分別為雌性小鼠17.10 g·kg-1，雄性小鼠10.80 g·kg-1，達到理論無毒的標準；王亞萍等[27]對長興吊瓜Trichosanthes bracteata籽油的食用安全性進行了評估。結果顯示：小鼠經口急性毒性試驗的半致死量高達40.00 mL·kg-1以上，表明吊瓜籽油實際無毒。本研究開展小鼠急性經口毒性的材料為莖葉，與上述試驗所用的材料為液態油脂有所不同，評判標準不一樣，小鼠的半致死質量分數也不同，但結果表明長喙毛茛澤瀉的莖葉為實際無毒。

長喙毛茛澤瀉是極度瀕危植物，野生種質資源極其稀少，導致了對其莖葉的營養元素質量分數和活性化學成分的測定研究難以開展。2015年起，浙江省麗水市相關單位開展了人工栽培的長喙毛茛澤瀉回歸原生地的項目研究，至2019年已在3個回歸示范點培育出了一定數量的苗，可供一個批次的指標測定和毒性試驗所需的樣品。由于所取的樣品數量有限，本研究僅對3個回歸示范點4份樣品的莖葉和根中的脂肪及8種常見營養元素質量分數進行了定量測定(由于檢測手段的限制未測定硫質量分數)，這與對中藥材澤瀉Alisma orientalis的測定偏重于三萜類等活性化學物質的報道[28]有所不同。本研究測定的指標不屬于活性物質，而且缺乏大量元素硫的測定結果，同時缺乏近緣物種的各項指標值作為參照，這是本研究的不足之處。下一步的研究應側重于莖葉活性化學成分的測定，并探討這些活性化學成分與植株毒理的關聯。