歐洲千里光CYCLOIDEA(CYC)類SvRAY1基因的克隆及功能分析

陳柯俐，樸春蘭，郝燕敏，馮麗君，周佳圓，欒思楠，劉樂樂，李菲菲，袁思明，崔敏龍

（1. 浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 杭州 311300；2. 浙江農林大學 園藝科學學院，浙江 杭州311300）

被子植物因擁有精密的花器官及豐富多樣的花型為人們普遍觀賞，其發育過程由高度精密的調控網絡所決定，轉錄因子在其中有重要的作用[1-2]。控制花發育的轉錄因子主要為TCP家族轉錄因子[3-4]，該家族轉錄因子以玉米Zea mays的TEOSINTE BRANCHED1(TB1)、金魚草Antirrhinum majus的CYCLOIDEA(CYC)及水稻Oryza sativa的PROLIFERATING CELL FACTORS1和PROLIFERATING CELL FACTORS2(PCF1和PCF2)基因的首字母命名，通過細胞增殖影響分生組織的生長而控制植物花對稱性或分蘗[5-8]。TCP家族蛋白包含有1個高度保守的 TCP結構域，即堿性螺旋-環-螺旋(basic Helix-Loop-Helix,bHLH)結構，該結構與DNA結合位點及蛋白的二聚化有關[9]。根據bHLH結構可將TCP家族分為2個亞家族：PCF(又稱TCP-P或I類)和CYC/TB1(又稱TCP-C或Ⅱ類)[10]。CYC/TB1類蛋白由CINCINNATA(CIN)和ECE進化枝組成，ECE譜系經歷了2次復制事件，產生CYC1、CYC2和CYC3進化枝，而CYC2進化枝參與花對稱性的建立。菊科Asteraceae植物進化成功的原因可歸功于其精美的花序結構[11]，使其看起來像一朵單獨的花，實則由數十朵乃至百朵舌狀花及筒狀花構成。花序外緣為舌狀花(ray floret)，兩側對稱、無雄蕊、艷麗多彩，主要用來吸引蟲媒授粉。花序內側為筒狀花(disc floret)，輻射對稱，一般含有雄蕊或者兼具雌雄蕊，主要用來完成世代繁殖。菊科種類及數目繁多，具有很高的經濟與觀賞價值。對于菊科而言，頭狀花序能夠產生不同類型花是其繁衍的主要創新之處。對菊科中CYC類基因的分析發現：基因的重復和分支是生物體進化決定過程中常見的現象，是其獨特性和進化成功的主要因素。歐洲千里光Senecio vulgaris為菊科植物，分布于世界各地，其生長周期短(90 d)、繁殖能力強、易于生長，花序具有天然多態性，分為輻射對稱與非輻射對稱。該天然多態性由CYC2類RAY基因座所控制。RAY基因的表達通過調控舌狀花的形態最終影響了歐洲千里光的花對稱性，即輻射對稱與非輻射對稱之間的過渡或轉化[12]，然而，人們對于這種形態上的變化原因并未做出深入探究。本研究在歐洲千里光RAY1基因研究的基礎上，克隆SvRAY基因并分析其過表達表型影響因素，旨在為菊科花序發育的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以歐洲千里光種子為實驗材料，在25 ℃、光周期16 h光/8 h暗條件下被種植于人工氣候室。

1.2 SvRAY1基因的克隆及其超表達載體的構建

下載歐洲千里光RAY1基因序列(FJ356698.1)并在美國國家生物信息中心(NCBI)進行引物設計比對(Primer-BLAST)，利用NEBcutter V 2.0 (http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)網站分析其潛在酶切位點；添加BamHⅠ、SacⅠ等酶切位點及保護堿基，引物由杭州有康生物有限公司合成(表1)。以歐洲千里光cDNA序列為模板，克隆獲得SvRAY1基因目的片段。PCR反應程序：97 ℃預變性3 min，95 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，72 ℃總延伸10 min，35個循環；目的片段純化回收后連接至pEASY-T1Simple載體(全式金)，并轉化大腸埃希菌Escherichia coli感受態DH5α菌株中(杭州有康生物公司)，根據藍白斑篩選及菌落PCR實驗后挑取菌落搖菌送至杭州有康生物公司測序。

表1 本研究中SvRAY1基因克隆和用于 qRT-PCR 的引物序列Table 1 Primers were used for cloning of SvRAY1 and qRT-PCR analysis in this study

提取測序正確菌落質粒，進行BamHⅠ和SacⅠ限制性內切酶的單雙酶酶切檢驗，并對重組質粒及超表達載體pBI121進行雙酶切反應，將目的片段與載體片段進行酶連，轉化大腸埃希菌DH5α后，挑取單克隆進行菌落PCR。挑選陽性克隆子并搖菌提取質粒，進行單、雙酶切檢驗酶連正確后轉化到農桿菌Agrobacterium tumefaciensGV3101，獲得超表達載體(圖1)。

圖1 SvRAY1基因超表達載體示意圖Figure 1 Schematic diagram of overexpression vector of SvRAY1

1.3 SvRAY1 基因生物信息學分析

將克隆的SvRAY1基序在NCBI網站進行Blastx檢索，下載各物種CYC基因氨基酸FASTA格式文件；利用Clustal X及MEGA 10軟件，采用最大似然法，步長設置為1 000，進行多序列比對及系統發育樹的構建，使用GeneDoc軟件及iTOL在線工具(https://itol.embl.de/login.cgi)[13]顯示比對結果及進化樹美化修飾；利用MEME網站(http://memesuite.org/tools/meme)[14]、SOPAM在線軟件 (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)[15]、SWISS-MODEL 在線建模工具(http://swissmodel.expasy.org/)[16]分析SvRAY1基序氨基酸豐度，預測氨基酸序列二級結構組分、比例及其分布信息、蛋白質的三維結構。

1.4 SvRAY1 基因實時熒光定量表達分析

研究歐洲千里光生長的2個階段：營養生殖過渡階段-花序(cap)和生殖發育階段(S1～S4) (圖2)的SvRAY1基因的表達情況。根據實時熒光定量PCR反應(qPCR)引物設計原則設計特異引物qSvRAY1F、qSvRAY1R及內參基因引物Sv18sF、Sv18sR。參照RNA提取試劑盒RNAeasy PLANT Mini Kit(QIAGEN)、cDNA合成試劑盒EasyScriptFirst-strand cDNA Synthesis SuperMix (全式金)說明書，使用Eva Green熒光染料 (Biotium)、premix Ex Taq HotStart Version (Takara)提取RNA并合成cDNA后于實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad, CFX ConneaTM Real-T)上進行反應。反應體系：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 變性 10 s，60 ℃ 退火 15 s，72 ℃ 延伸 25 s，共進行45個循環。試驗設置3個重復反應，并采用法計算各部位、階段SvRAY1基因的相對表達量。

圖2 歐洲千里光頭狀花序的不同發育階段形態比較Figure 2 Comparison of capitulum form of different developmental stages of S. vulgaris

1.5 SvRAY1 轉基因植株鑒定及形態學觀察分析

利用植物組織培養技術經卡那霉素篩選獲得SvRAY1轉基因抗性植株[12]。利用改良的SDS法[加入質量分數為2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)處理，防止酚類物質氧化抑制PCR反應]提取抗性植株基因組DNA后，使用卡那霉素引物及特異性引物進行PCR檢測后獲得陽性苗。觀察并統計野生型歐洲千里光及陽性苗舌狀花長寬、筒狀花與舌狀花數目之比等，并采用t檢驗進行數據整理。使用掃描電子顯微鏡觀察野生型及SvRAY1轉基因植株的舌狀花腹側表皮細胞，分析其細胞形態。

1.6 數據分析

使用Excel 2016、SPSS 25.0等軟件進行顯著性分析及圖表制作。使用SPSS 25.0軟件，分別輸入野生型及轉基因舌狀花的相關數據，通過成對樣本t檢驗，分析比較平均值，默認置信區間為95%。檢驗方差齊次性，進一步進行t檢驗，查看雙尾顯著性值，判斷野生型與轉基因植株間方差顯著性。

2 結果與分析

2.1 SvRAY1 基序生物信息學分析

將克隆出的SvRAY1基序在NCBI進行Blastx分析，對其中與SvRAY1基因編碼氨基酸序列相似性較高的序列進行篩選，并將篩選出來的翠菊Callistephus chinensis CcCYC2d、橙舌狗舌草Tephroseris rufa TrCYC2d、杭白菊Chrysanthemum×morifoliumCmCYC2d、甘菊Chrysanthemum lavandulifoliumClCYC2d、非洲菊Gerbera hybridaGhCYC2c和GhCYC5等基因氨基酸進行系統進化樹的構建(圖3)。系統發育進化樹表明：SvRAY1與CcCYC2d、TrCYC2d、HaCYC2d、DvCYC2d等處于同一分支，親緣關系近。

圖3 SvRAY1系統發育進化樹分析Figure 3 SvRAY1 phylogenetic tree analysis

SvRAY1氨基酸序列空間二級結構(圖4)表明：無規卷曲所占比例52.89%，超過總結構元件比例的一半，其次分別為α螺旋、延長鏈及β轉角，所占比例分別為33.13%、10.64%、3.34%。其蛋白結構模型與經典金魚草花對稱AmCYC蛋白結構模型相似，有明顯的折疊層次，結構單元主要為α螺旋及無規卷曲，且它們的蛋白結構中有一活性部位，推測SvRAY1基因具有AmCYC基因的功能保守性，即可能參與調控花發育過程中花對稱性的形成。

圖4 SvRAY1氨基酸序列二級、三級結構組分及其比例分布Figure 4 Secondary and tertiary structure components of SvRAY1 amino acid sequence and their ratios

2.2 SvRAY1 基因不同發育階段表達分析

qRT-PCR反應結果表明(圖5)：SvRAY1基因在各階段均有表達， S1～S4階段相對表達量均比花序階段高，且S3、S4階段舌狀花(S3R、S4R)中相對表達量均高于筒狀花(S3T、S4T)，表明SvRAY1基因主要在舌狀花部位中表達，且舌狀花的相對表達量最高，故推測其過表達可能影響舌狀花發育。

圖5 SvRAY1基因在歐洲千里光不同發育時期和不同部位的相對表達分析Figure 5 Expression analysis of SvRAY1 in different floral development stages and tissues of wild type S. vulgaris by qRT-PCR

2.3 SvRAY1 轉基因植株表型觀察

分別選取6株野生型及經分子鑒定的SvRAY1超表達載體植株，每株隨機選取5個，共30個頭狀花序進行形態學統計(舌狀花長寬、筒狀花與舌狀花數目之比)，并進行成對樣本t檢驗分析(表2)。結果表明：與野生型相比，SvRAY1轉基因植株舌狀花長度較野生型不同程度變短，各轉基因株系寬度均顯著變寬(P＜0.05)，舌狀花與筒狀花數目之比也有顯著差異。

表2 舌狀花形態統計學分析Table 2 Statistical comparison of ray floret morphology between wild type and transgenic S. vulgaris

探究SvRAY1轉基因舌狀花變寬原因，使用掃描電子顯微鏡觀察其腹側表皮細胞，分析細胞數目及形態變化。與野生型相比，轉基因SvRAY1植株舌狀花表皮細胞形態發生不同程度的變化。舌狀花遠軸端尖端細胞較野生型小、分布密集；中軸端細胞邊緣由彎曲變為平滑且細胞變寬變短，表明轉基因SvRAY1植株可能因為細胞分裂旺盛(圖6紅色曲線標注)，使舌狀花整體變寬。

圖6 野生型及SvRAY1舌狀花腹側表皮細胞掃描電鏡形態差異觀察Figure 6 Observation of adaxial epidermal cell differentiation between wild type and transgenic S. vulgaris by SEM

3 討論

被子植物精美的花器官具有很高的觀賞價值，同時也具有遺傳繁殖功能[1]。菊科植物頭狀花序中的舌狀花配合筒狀花遺傳生殖功能進行蟲媒吸引，兩者相互協調，其復雜性與授粉專業化、異交率、遺傳多樣性、物種進化和快速繁殖有關[11]，從而促使菊科植物在進化史上發生數目與種類的急劇增加。核心雙子葉植物中，CYC2基因可作為花對稱性調控因子參與花對稱性的建立，而菊科中舌狀花花對稱性的建立使其更好地與筒狀花進行功能適應。

文獻報道[12]認為：歐洲千里光RAY1基因過表達參與舌狀花長度的變化，舌狀花變短，但未深入探究其產生原因，故本研究克隆SvRAY1基因，進一步研究舌狀花花型變化原因。生物信息學技術表明：克隆的SvRAY1基因與CcCYC2d、TrCYC2d處于同一分支，蛋白結構與AmCYC相似，預測所克隆的SvRAY1基因具有CYC基因保守功能。

對非洲菊GhCYC2[11]、向日葵Helianthus annuus HaCYC2c、HaCYC2d基因[17]舌狀花花原基中的表達研究表明：這些基因主要在舌狀花中表達，且通過影響細胞增殖調節舌狀花大小。構建歐洲千里光pBI121-35s::SvRAY1過表達載體，并對各階段花發育表達量進行分析。該轉基因植株隨著生長發育SvRAY1基因的表達量隨之上升，且主要在S3、S4階段的舌狀花中表達，表達量是同時期筒狀花的1.5～2.0倍，進一步推測SvRAY1基因過表達可能主要定位在舌狀花S3、S4階段，且對歐洲千里光舌狀花表皮細胞發育影響最大。觀察轉基因SvRAY1植株并進行形態學統計，舌狀花長度不同程度變短，寬度顯著變寬，舌狀花與筒狀花數目之比也有顯著性。SvRAY1轉基因舌狀花表型不但與RAY1過表達表型相似且獲得了不同表型。

掃描電子顯微鏡觀察到舌狀花顯著變寬的SvRAY1-6轉基因植株腹側表皮細胞。遠軸端及中軸端細胞較野生型變小，分裂旺盛，但遠軸端細胞形態變化不大，中軸端細胞除變小變短外，其細胞形態也發生了變化，即由邊緣彎曲變為平滑。轉基因舌狀花不同部位表皮細胞數目及形態的變化共同影響了舌狀花的發育，其中中軸端的細胞變化可能對舌狀花變寬起到主要的影響。金魚草CYC、DICH和藍豬耳Torenia fournieri CYC及苦苣苔科Gesneriaceae非洲堇Saintpaulia ionantha SiCYCA基因過表達以不同形式調節細胞分裂，因此，CYC基因可能通過控制表皮細胞數目、大小及形態等調控花器官發育。SvRAY1基因行使的功能與上述基因相似[6-7,18-19]，即CYC2類SvRAY1基因可能通過細胞分裂、細胞形態變化從而影響舌狀花的發育。

同時，SvRAY1基因過表達舌狀花與筒狀花數目比例較野生型高，即舌狀花數目較野生型多，擁有更好吸引蟲媒的條件，較野生型更能吸引蟲媒授粉，完成生殖繁衍功能。而在向日葵、非洲菊及杭白菊CYC基因突變體及過表達株系中，或通過筒狀花與舌狀花之間的轉變[20-21]，或改變舌狀花的長度、數目[22]使花序小花組成及花序大小發生變化，行使與SvRAY1基因過表達相似功能，更好地完成世代繁衍任務。

菊科頭狀花序很復雜，雖然其發育存在著一定生化功能上的保守性，但舌狀花與筒狀花發育存在著時間、空間的表達多變性以及功能多樣化[13]。除了已知的CYC2類基因調控菊科花型外，還有其他未知的基因以及其他途徑共同調控花型變化模式。一些研究表明：激素可能參與CYC基因調節途徑，可能影響花對稱性的形成。例如擬南芥Arabidopsis thaliana的生長素和獨腳金內酯合成突變體中，TCP18表達量降低，表明激素可能影響TCP家族基因表達[23]。CYC基因為TCP家族成員之一，金魚草中CYC基因調節細胞分裂，歐洲千里光SvRAY1影響細胞分裂，調整舌狀花表型，因此，CYC與激素調節途徑的研究可在以后的實驗中進一步研究。

菊科中，通常認為舌狀花的存在與否由關鍵的一二個基因或一些其他基因所修飾[24]。這些基因間的表達并不是獨立的，大多可互作或者通過基因網絡調控[25]，或通過CYC基因間，或與ABC基因協同調控頭狀花序發育，例如：菊花CmCYC2f基因作為CmCYC2c下游靶標，誘導菊花中特定花的分化[25]以及CmCYC2b-CmCYC2d、CmCYC2b-CmCYC2e和CmCYC2c-CmCYC2d蛋白間相互作用形成蛋白二聚體[26]，菊花A類基因與CYC2類基因相互作用參與筒狀花和舌狀花的分化[27]。金魚草花對稱模式CYCDICH-RAD-DIV調控網絡，煙葉苣苔Primulina heterotricha的CYC1C與CYC1D的雙正向自調控反饋環[28]等通過基因調控網絡作用于花型的發育。各種調控元件通過對發育調控網絡進行修飾、改變，致使被子植物花型多種多樣。因此，后續可以繼續研究SvRAY1基因間互作，SvRAY1基因與其他花發育基因等的互作，共同參與花型的調控。