Box-Behnken設計優化小兒消積止咳制劑提取純化工藝△

高艷紅，劉金宇，曹玲，崔琳琳，關永霞*，張貴民

1.魯南制藥集團股份有限公司 中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006；

2.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006

小兒消積止咳制劑（口服液/顆粒）組方來源于山東中醫藥大學附屬醫院兒科名老中醫畢可恩的臨床經驗方，由山楂、檳榔、枳實、枇杷葉、瓜蔞、連翹、萊菔子、葶藶子、蟬蛻和桔梗10 味中藥制成，具有清熱肅肺、消積止咳的功效[1]，臨床上用于小兒飲食積滯、痰熱蘊肺所致的咳嗽、喉間痰鳴、腹脹、口臭的治療[2]，療效顯著，填補了國內治療小兒食積咳嗽中成藥的空白。文獻報道其與阿奇霉素聯合治療小兒支原體肺炎亦有很好的療效[3-5]。小兒消積止咳制劑的提取純化工藝主要為水提醇沉[2]，本研究在多年生產數據積累的基礎上，用SPSSAU 熵值法確定了各因素的權重，確定以辛弗林轉移率、柚皮苷轉移率和干物質得率的綜合評分為考察指標，采用Box-Behnken 設計進行工藝優化[6]，最終得到了最佳提取純化工藝。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；XS204 型電子分析天平（Mettler-Toledo公司）。

1.2 試藥

對照品辛弗林（批號：110727-201809，純度：99.5%）、柚皮苷（批號：110722-201815，純度：93.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院。

小兒消積止咳制劑提取液、醇沉液（中藥制藥共性技術國家重點實驗室）；甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 辛弗林的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取辛弗林對照品適量，加入50%的甲醇制成質量濃度為20 μg·mL-1的溶液，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：TURNER Kromasil 100A C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇-磷酸二氫鉀溶液（取磷酸二氫鉀0.6 g，十二烷基磺酸鈉1.0 g，冰醋酸1 mL，加水溶解并稀釋至1000 mL）=15∶30∶55；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測波長：224 nm。

2.1.4 含量測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2 柚皮苷的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 取柚皮苷對照品適量，精密稱定，加入50%甲醇制成質量濃度為60 μg·mL-1的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取提取液/醇沉液適量（折合成品0.5支/袋），至50 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（35∶65），流速：0.8 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測波長：283 nm。

2.2.4 含量測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.3 干物質得率測定

干物質得率測定方法參考《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版（四部）通則0831“干燥失重測定法”，精密量取提取液/醇沉液10 mL，稱量，記錄質量，水浴蒸干，置于105 ℃烘箱，干燥至質量恒定，干燥器中冷卻至室溫，稱質量，計算干物質得率。

秦鐵崖不急不躁，依然用跳步和滑步來避開對方重拳，同時用快拳擊打對方，間以龍爪手襲擾。有幾次，秦鐵崖的龍爪手已經扣住對方手臂，誰知沒等他發力，對手故技重施，兩臂往上一振，肌腱鼓蕩，秦鐵崖便抓握不住。

2.4 評價指標

《中國藥典》2020 年版一部小兒消積止咳口服液項下的含量測定項為辛弗林，小兒消積止咳顆粒的含量測定項為柚皮苷。此外，干物質得率也是衡量工藝的重要指標。根據多年生產數據，經SPSSAU 熵值法計算確定，水提工藝綜合指標（Y1）中辛弗林轉移率（R1）、柚皮苷轉移率（R2）、干物質得率（R3）的權重系數分別為23.15%、21.98%、54.87%，醇沉工藝綜合指標（Y2）中辛弗林轉移率（R4）、柚皮苷轉移率（R5）、干物質轉移率（R6）的權重系數分別為32.97%、38.48%、28.55%。

2.5 水提單因素試驗

2.5.1 料液比對水提工藝的影響 固定提取時間為60 min，提取數為2次，考察料液比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10）對水提效果的影響，結果見圖1。由圖1 可知，料液比在1∶4～1∶8 時，料液比增加，Y1隨之增加，當料液為1∶8～1∶10 時，Y1趨于穩定。因此，選擇料液在1∶6～1∶8進行后續Box-Behnken響應面優化水提工藝。

圖1 料液比對小兒消積止咳制劑水提效果的影響（, n=4）

2.5.2 提取數對水提工藝的影響 固定提取時間為60 min，料液比為1∶8，考察提取數（1、2、3、4次）對水提效果的影響，結果見圖2。由圖2 可知，提取數在1～4 時，隨著提取數的增加，Y1先增加后略有降低。因此，選擇提取數在1～3 進行后續Box-Behnken響應面優化水提工藝。

圖2 提取數對小兒消積止咳制劑水提效果的影響（, n=4）

2.5.3 提取時間對水提工藝的影響 固定料液比為1∶8，提取數為2 次，考察提取時間（30、60、90、120、150 min）對水提效果的影響，結果見圖3。由圖3 可知，隨著提取時間的增加，Y1先增加后降低。因此，選擇提取時間60～120 min 進行后續Box-Behnken響應面優化水提工藝。

圖3 提取時間對小兒消積止咳制劑水提效果的影響（,n=5）

2.6 Box-Behnken響應面法優化水提工藝

2.6.1 水提方案設計及試驗結果 依據Box-Behnken 響應面試驗設計原理，結合上述水提單因素試驗結果，進行因素水平設計與試驗。因素水平見表1，設計及結果見表2～3。

表1 小兒消積止咳制劑水提工藝因素水平

表2 小兒消積止咳制劑水提工藝Box-Behnken響應面試驗設計及結果

2.6.2 水提模型擬合及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行分析，得到回歸方程 ：Y1=57.58+5.79A+1.31B+1.03C+0.83AB -0.52AC-0.019BC-4.32A2-1.28B2-0.82C2，r=0.923 2。結果顯示，建立的回歸整體模型P<0.01。失擬項P>0.01，不顯著，模型成立。

A 和A22 個因素差異有統計學意義（P<0.01），B 差異有統計學意義（P<0.05）；3 個因素對Y1的交互影響分別見圖4～6，可看出，A的響應面曲線陡峭且等高線密集，因此，對水提效果影響最大的因素為料液比。

圖4 料液比和提取數對小兒消積止咳制劑水提工藝的影響

2.6.3 水提工藝驗證 通過模型分析可以確定水提最佳工藝：料液比為1∶8，提取數為2.84 次，提取時間為99 min，此時Y1max=60.02。結合生產實際，修正最佳提取工藝：料液比為1∶8，提取數為3次，提取時間為100 min。在該工藝下重復試驗3 次，Y1分別為59.58、59.63、58.73，平均值為59.31，RSD 為0.85%，接近預測值，說明優選的水提工藝穩定可行。

表3 小兒消積止咳制劑水提工藝響應面二次回歸方程方差分析結果

2.7 醇沉單因素試驗

2.7.1 浸膏相對密度對醇沉工藝的影響 固定醇沉時間為24 h，醇沉醇度為60%，考察醇沉前浸膏相對密度（1.10、1.15、1.20、1.25、1.30）對醇沉效果的影響，結果見圖7。由圖7可知，隨著相對密度的提高，Y2先增加后降低。因此，選擇相對密度1.15～1.25進行后續Box-Behnken響應面優化醇沉工藝。

圖5 料液比和提取時間對小兒消積止咳制劑水提工藝的影響

圖6 提取數和提取時間對小兒消積止咳制劑水提工藝的影響

圖7 浸膏相對密度對小兒消積止咳制劑醇沉效果的影響（,n=5）

2.7.2 醇沉醇度對醇沉工藝的影響 固定醇沉前浸膏相對密度為1.23，醇沉時間為24 h，考察醇沉醇度（50%、60%、70%、80%）對醇沉效果的影響，結果見圖8。由圖8 可知，隨著醇沉醇度的提高，Y2先增加后降低。因此，選擇醇沉醇度50%～70%進行后續Box-Behnken響應面優化醇沉工藝。

2.7.3 醇沉時間對醇沉工藝的影響 固定醇沉前浸膏相對密度為1.23，醇沉醇度為60%，考察醇沉時間（12、24、36、48 h）對醇沉效果的影響，結果見圖9。由圖9 可知，隨著醇沉時間的增加，Y2先增加后趨于穩定。因此，選擇醇沉時間12～36 h進行后續Box-Behnken響應面優化醇沉工藝。

圖9 醇沉時間對小兒消積止咳制劑醇沉效果的影響（,n=4）

2.8 Box-Behnken響應面法優化醇沉工藝

2.8.1 醇沉方案設計及試驗結果 依據Box-Behnken 響應面試驗設計原理，結合上述醇沉單因素試驗結果，進行因素水平設計與試驗。因素水平見表4，試驗設計及結果見表5～6。

表4 小兒消積止咳制劑醇沉因素水平

表5 小兒消積止咳制劑醇沉工藝Box-Behnken響應面試驗設計及結果

表6 小兒消積止咳制劑醇沉工藝響應面二次回歸方程方差分析結果

2.8.2 醇沉模型擬合及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行分析，得到回歸方程：Y2=74.79+5.15D-0.83E-2.74F-1.88DE-4.11DF+2.22EF -9.73D2-6.38E2-6.39F2，r=0.971 5。結果顯示，建立的回歸整體模型其P<0.01，達到極顯著水平。失擬項P>0.01，不顯著，模型成立。由結果分析可知，以Y2為響應值時，模型一次項影響順序分別為D>F>E，其一次項D、二次項DF、D2、E2、F2差異有統計學意義（P<0.001），一次項F、二次項DE、EF 差異有統計學意義（P<0.05）；3個因素對Y2的交互影響分別見圖10～12。

圖10 浸膏相對密度和醇沉醇度對小兒消積止咳制劑醇沉效果的影響

2.8.3 醇沉工藝驗證 通過模型分析可以確定醇沉最佳工藝：浸膏相對密度1.218，醇沉醇度58.2%，醇沉時間19.68 h，在此條件下，評價指標Y2max=76.28。結合生產實際，修正最佳醇沉工藝為浸膏相對密度1.20，醇沉醇度60%，醇沉時間20 h。在該工藝下重復試驗3 次，Y2分別為76.16、75.19、75.87，平均值為75.74，RSD 為0.66%，接近預測值，說明模型可靠，優選的醇沉工藝可行。

3 結論

小兒積食是指因食物積滯于內而出現不思飲食、腹脹、腹痛、嘔吐等，嚴重影響小兒消化吸收及生長發育。目前，臨床西醫治療小兒急性支氣管炎伴積食主要以抗生素控制感染及對癥干預為主，可有效促進患兒癥狀改善及病情恢復，但尚無法完全滿足臨床需求[7]。近年來，中醫藥在兒科疾病的診治中發揮著越來越重要的作用，中藥制劑可根據小兒的生理病理特點，發揮中醫整體觀念、辨證論治的優勢，在改善臨床癥狀的同時減少病原體的侵襲，而且不良反應較少[8]。小兒消積止咳制劑是一種具有清熱肅肺、消積止咳功效的中成藥，可用于治療小兒痰熱蘊肺所致的咳嗽，在臨床中常與阿奇霉素聯合用于小兒支原體肺炎的治療，并取得了良好的療效[4]。

Box-Behnken 是一種優化多變量系統的統計方法，可通過多元二次回歸方程擬合多個因素與多個響應值之間的函數關系，通過回歸方程數學模型尋求最佳條件和參數，從而獲得較為精確的最佳工藝參數和響應目標的最優值[9]。近年來，該方法已經被廣泛應用于中藥及復方有效成分的提取純化工藝優化。

本研究采用Box-Behnken 對小兒消積止咳制劑的提取純化工藝進行優化，使處方中各藥的有效成分最大限度地溶出，并盡可能降低雜質的含量，以增加制劑的穩定性，提高臨床療效。最終優選出的提取純化條件為料液比1∶8，提取數為3 次，提取時間為100 min，醇沉浸膏相對密度1.20，醇沉醇度60%，醇沉時間20 h。經驗證，應用Box-Behnken設計所得的小兒消積止咳制劑純化工藝穩定可行、重現性良好，為后續藥物制劑及臨床藥效的發揮提供參考。

圖11 浸膏相對密度和醇沉時間對小兒消積止咳制劑醇沉效果的影響

圖12 醇沉醇度和醇沉時間對小兒消積止咳制劑醇沉效果的影響