金鐵鎖種子質量檢驗方法與分級標準△

熊永興，曾宇君，蘇鈦，李云，周國華，楊成金*

1.云南省藥物研究所/云南省中藥和民族藥新藥創制企業重點實驗室，云南 昆明 650111；

2.云南白藥集團中藥資源有限公司，云南 昆明 650111；

3.云南白藥集團麗江藥業有限公司，云南 麗江 674100

種子是中藥材生產的源頭，種子檢驗是保證種子質量的重要措施和手段[1]。目前，我國除人參、三七等種子有國家標準外，其他大部分中藥材種子的檢驗規程和質量分級標準還處于空白狀態。金鐵鎖為石竹科植物金鐵鎖Psammosilene tunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu 的干燥根[2]，始載于明代蘭茂所著《滇南本草》[3]，俗稱獨定子、獨丁子、昆明沙參、金絲矮陀等，是中國稀有種和特有單種屬植物，為國家二級保護植物。其于1974 年載入《云南省藥品標準》，之后進入《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）1977 年版，具有祛風除濕、散瘀止痛、解毒消腫的功效，用于治療風濕痹痛、胃脘冷痛、跌打損傷、外傷出血等[4-6]，是云南民間治療風濕、跌打損傷的主要藥物之一。隨著野生資源的枯竭，金鐵鎖種植規模得到快速發展，但種源市場秩序混亂，種子質量良莠不齊，種植效果差異較大[7-8]。為此，本研究參照《農作物種子檢驗規程》及相關文獻[9-11]，對金鐵鎖種子的凈度、千粒質量、真實性鑒定、生活力的檢驗方法及發芽條件進行了系統研究，制定金鐵鎖種子的檢驗方法，建立金鐵鎖種子的質量分級標準，以期為金鐵鎖的規模化、規范化種植提供參考。

1 材料

金鐵鎖主要分布在金沙江和雅魯藏布江沿岸海拔2000～3800 m 的礫石山坡或石灰質巖石縫中，人工種植主要集中在云南西部和西北部，四川省的川西、甘孜、涼山及貴州省畢節地區[12-14]。本課題組對金鐵鎖的主產區進行實地走訪調查，在云南、四川采集樣品36 批，經云南省藥物研究所邱斌正高級工程師鑒定為石竹科植物金鐵鎖Psammosilene tunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu 的種子，種子信息見表1。

表1 金鐵鎖種子信息

KMnO4、NaClO、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

MT204T 型分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；D101 型電熱鼓風干燥箱（上海實驗儀器有限公司）；MGC-450HP 型光照培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

2 方法

2.1 扦樣

按《農作物種子檢驗規程》（GB/T 3543.3—1995）中四分法扦樣。

2.2 凈度分析

金鐵鎖為總狀花序，種子細小，采收時成熟度常不一致，飽滿與否難以進行準確鑒定。按《農作物種子檢驗規程》（GB/T 3543.3—1995）中廣義凈度分析方法，每批樣品重復3次。

2.3 其他植物種子數目測定

按《農作物種子檢驗規程》（GB/T 3543.3—1995）扦樣方法，每批樣品重復2次。

2.4 真實性鑒定

采用外觀形態觀察測量法，從混合樣品中隨機抽取100 粒凈種子逐粒觀察種子形態、大小、顏色、表面特征及其他情況，用數顯卡尺測量種子的長、寬、厚，記錄數據，確定鑒別特征，每批樣品重復3次。

2.5 質量測定

采用百粒法、五百粒法和千粒法測定種子質量。百粒法：隨機從混合樣品中數取100 粒種子，稱質量，重復8 次，計算RSD 及變異系數。五百粒法：隨機從混合樣品中數取500 粒種子，稱質量，重復4 次，計算RSD 及變異系數。千粒法：隨機從混合樣品中數1000 粒種子，稱質量，重復2 次，計算重復間差數與平均數之比。

2.6 含水量測定

采用（130±2）℃恒溫烘干法和（105±2）℃恒溫烘干法，每份試樣稱取種子樣品約4 g，重復3 次。連續稱質量，以2次質量之差<0.2%為恒重。

2.7 生活力測定

采用L16（43）正交設計，隨機數取凈種子100粒，常溫條件下用蒸餾水浸泡12 h，去除果皮和種皮，取出胚和子葉放入培養皿中，分別倒入0.15%、0.10%、0.05%、0.01% TTC 溶液，置于25、30、35、40 ℃避光恒溫培養箱染色，每1 h觀察1次并統計染色情況。每個處理100粒種子，重復3次。

2.8 發芽試驗

2.8.1 發芽前處理 取金鐵鎖種子，分別用純化水、0.1%、0.2%、0.3% KMnO4和1.0%、2.5%、5.0%NaClO處理10 min，備用。

2.8.2 發芽條件選擇 取凈種子粒置濾紙和細砂上，分別在15、20、25 ℃恒溫培養箱里光照12 h·d-1和黑暗處理，保持培養皿內水分充足，每日查看并記錄種子發芽情況，隨時挑出腐爛種子并統計。每個處理100 粒種子，4 次重復。

2.9 種子分級標準

采用上述研究確定的檢驗方法，對收集的36 份金鐵鎖種子進行凈度、真實性、千粒質量、含水量、生活力、發芽率測定。通過對數據進行相關性分析、K-均值聚類分析和標準差分析，制定金鐵鎖種子質量分級標準。

3 結果與分析

3.1 扦樣

金鐵鎖種子凈度分析種子每批最大質量為1000 g，送檢樣品最少為100 g，凈度分析樣品最少為10 g。

3.2 凈度分析

金鐵鎖種子平均凈度達87%，各組樣品種子質量的差值均沒有偏離原始質量的5%，檢驗結果有效。

3.3 其他植物種子數目測定

平均每10 g 金鐵鎖種子含其他植物種子226.5 粒，平均每千克金鐵鎖種子含其他植物種子2265 粒，樣品其他種子數的組間差距為17，在容許差距范圍內，檢驗結果有效。

3.4 真實性鑒定

金鐵鎖種子為蒴果棒狀，種子狹倒卵形，長約（5.24±0.48）mm、寬約（1.38±0.20）mm、厚約（0.97±0.13）mm，黃綠色。

3.5 質量測定

結果顯示，百粒法和五百粒法的變異系數>4%，千粒法的變異系數<4%。因此，金鐵鎖種子質量測定應采用千粒法。金鐵鎖種子質量測定結果見表2。

表2 金鐵鎖種子質量測定結果

3.6 含水量測定

金鐵鎖種子采用低恒溫烘干法時，前4 h迅速失去水分，隨后失水緩慢，種子含水量趨于穩定，7 h達到恒重，含水量為10.07%。高溫烘干法前2 h 種子迅速失水，隨后失水緩慢，種子含水量趨于穩定，4 h 時達到恒重，含水量為10.35%。2 種方法比較，金鐵鎖種子含水量測定宜選擇高恒溫烘干法。金鐵鎖種子含水量測定結果見圖1。

圖1 金鐵鎖種子不同測定時間的含水量

3.7 生活力測定

3.7.1 生活力標準的確定 有生活力的金鐵鎖種子胚軸、子葉被TTC 溶液染為鮮紅色或淺紅色，染色均勻；無生活力的金鐵鎖種子胚軸、子葉完全不著色或著淺色，染色不均勻，或局部著色，著色較淺（圖2）。

圖2 金鐵鎖種子TTC染色效果

3.7.2 生活力測定影響因素 由表3 可以看出，對金鐵鎖種子著色的影響因素中，染色時間>染色溫度>TTC 質量分數，各溫度、TTC 質量分數下，金鐵鎖種子均表現出染色時間越長染色效果越好；3 h內，溫度越高著色率越高，但是隨著染色時間的延長，30 ℃時染色率開始升高，且低質量分數TTC表現出優勢染色（表3）。因此，選擇0.01% TTC溶液、30 ℃下浸種6 h 作為金鐵鎖種子生活力測定的最佳條件。

表3 不同溫度、不同TTC質量分數和不同染色時間對金鐵鎖種子的染色效果（, n=3）

表3 不同溫度、不同TTC質量分數和不同染色時間對金鐵鎖種子的染色效果（, n=3）

注：同列不同小寫字母表示P＜0.05；表4同。

3.8 發芽試驗

3.8.1 發芽前處理 發芽前未進行消毒處理的金鐵鎖種子霉爛率達36.5%，消毒處理后能有效降低種子霉爛率。其中，用2.5% NaClO 消毒處理的種子發芽率最高為89%，種子霉爛率最低為11%。故金鐵鎖種子發芽前應先用2.5% NaClO 處理，以降低霉爛率。

3.8.2 發芽試驗條件確定 金鐵鎖種子在濾紙和細砂上均能萌發，且在不同溫度和光照條件下，濾紙的發芽率和發芽指數較細砂均更高（除20 ℃黑暗條件下的發芽指數），所以濾紙更適合金鐵鎖種子的萌發；從濾紙各試驗組的發芽率和發芽指數來看，除15 ℃黑暗條件下高于光照條件外，其余均表現出光照條件下較高，且可明顯看出20 ℃下最高（表4）。因此，20 ℃下，采用濾紙做發芽床，給予光照的發芽率、發芽勢和發芽指數最高，該條件最適用于金鐵鎖種子發芽。

表4 不同溫度、不同發芽條件下金鐵鎖種子發芽率測定結果（,n=3）

表4 不同溫度、不同發芽條件下金鐵鎖種子發芽率測定結果（,n=3）

3.8.3 發芽計數時間確定 金鐵鎖種子置發芽床后第四天開始逐漸發芽，第七天后發芽速率明顯上升，15 d 后發芽率趨于平穩，發芽基本結束。因此，整個發芽計數時間應在第四至十五天，初次計數時間為4 d，末次計數時間為16 d。

3.9 種子質量檢驗方法

本研究從扦樣、凈度分析、其他植物種子數目測定、真實性鑒定、質量測定、含水量、生活力、發芽率8個指標對金鐵鎖種子質量檢驗方法進行研究，確定適用于金鐵鎖種子質量指標的檢驗方法，見表5。

表5 金鐵鎖種子質量檢驗方法

3.10 種子質量分級標準制定

3.10.1 種子質量檢測結果 根據表5 所示的金鐵鎖種子質量檢驗方法，測定從主產區收集的36 份金鐵鎖種子的發芽率、生活力、含水量、千粒質量、凈度、其他種子率6個質量指標，結果見表6。

表6 36份不同來源的金鐵鎖種子質量指標分析結果

3.10.2 分級指標的確定

3.10.2.1 相關性分析 對36 份金鐵鎖種子進行相關性分析（Pearson），結果見表7。結果顯示，有5 個測量指標均表現出極顯著的正相關關系（P<0.01）。種子的生活力、千粒質量和凈度對發芽率都有顯著的影響，千粒質量和凈度間，凈度和其他種子率間也存在著較好的相關關系；含水量與各指標間相關性不顯著，故不納入分級指標。故可采用發芽率、生活力、千粒質量、凈度和其他種子率5 個指標作為金鐵鎖種苗質量的分級指標。

表7 36份不同來源的金鐵鎖種子質量檢測標間的相關性分析

3.10.2.2K-均值聚類分析 由于JTS2016QN13 號種子生活力和發芽率明顯低于其他組，屬于不合格種子，故將其排除分級（后將分為不合格種子級別），剩下的35 組數據針對發芽率、生活力、千粒質量、凈度和其他種子率采用K-均值聚類進行分析，將種子質量分為3個等級，結果見表8。

表8 金鐵鎖種子各指標K-均值聚類分析結果

3.10.3 質量分級標準及評定方法 由于其他種子數是不易控制的變量，差異巨大，不宜將其作為分級的主要參考項目，故以金鐵鎖種子發芽率、生活力、千粒質量和凈度4 項指標的K聚類中心值作為金鐵鎖種子分級標準的主要參考值，結合生產實踐經驗和檢驗的可操作性，最終制定的金鐵鎖種子質量分級標準見表9。該分級方法采用最低定級原則，即任何一項指標不符合規定標準都不能作為相應等級的合格種子。

表9 金鐵鎖種子分級標準

4 討論

近年，金鐵鎖種子產量大，各地主要采用種子直播的生產方式。種子是金鐵鎖藥材規范化生產的首要條件和基礎，優質的種子對穩定和提高金鐵鎖藥材的產量和質量起著極為重要的作用。建立金鐵鎖種子檢驗規程和質量分級標準將為金鐵鎖的規范化生產奠定良好的基礎。

在種子分級標準的4 個參考指標中，發芽率、生活力最為重要，可以直接反映種子在田間的用量和出苗率，是實現種子效能的一個重要指標；千粒質量可反映種子成熟度和幼苗的長勢等情況。雖然，凈度和其他種子數、含水量的高低不是種子生物學特性所決定的，對種子質量的影響較小，但金鐵鎖為草本植物，且種子顆粒較小，采收加工時極易引入其他種子，易受人為因素和客觀因數的影響，播種后不易控制雜草，增加除草的困難，因此在制定金鐵鎖種子質量標準時應將凈度作為一個重要指標進行考慮。此外，發芽率的測定也需要在凈度的基礎上進行，所以凈度對種子質量標準等級的劃分具有重要的參考作用。種子含水量與種子發芽率無顯著相關性，只與種子的安全貯藏和種子壽命相關，一般情況下在干燥低溫條件下貯藏都有利于保持種子的活力。因此，把發芽率、生活力、千粒質量、凈度作為金鐵鎖種子質量分級的重要指標。其他種子數雖然與種子質量存在相關性，但因其受人為影響較大，可以通過后期加工改變，故不作為分級的主要參考項目。