基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討桃仁-紅花治療視網(wǎng)膜靜脈阻塞的作用機(jī)制

金 琪 郝曉鳳 謝立科 孫 梅

中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院眼底病、眼外傷科，北京 100040

視網(wǎng)膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是僅次糖尿病視網(wǎng)膜病變的視網(wǎng)膜血管疾病。認(rèn)為RVO的發(fā)生與血管炎癥、血栓形成、血流動(dòng)力學(xué)障礙有關(guān)[1]。眼科臨床治療以玻璃體腔注射抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）藥物為主[2]，但需反復(fù)注射，增加了眼內(nèi)炎風(fēng)險(xiǎn)，加劇了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。RVO 屬于中醫(yī)“視瞻昏渺”的范疇，以絡(luò)脈瘀阻為關(guān)鍵，治法以活血化瘀為第一要義。本團(tuán)隊(duì)在探究臨床中醫(yī)藥治療RVO 的組方規(guī)律時(shí)[3]，發(fā)現(xiàn)桃仁-紅花藥對居于前列。

“藥對”又稱對藥，是介于單位藥和復(fù)方之間的配伍單元，其臨床應(yīng)用為中醫(yī)藥臨證化裁的充分體現(xiàn)。出自《醫(yī)宗金鑒》的“桃仁-紅花”是臨床活血化瘀的經(jīng)典藥對之一[4]。桃仁，苦，甘，性平，歸心、肝、大腸經(jīng)，有小毒，活血祛瘀，潤腸通便，止咳平喘[5]。紅花，辛，性溫，歸心、肝經(jīng)，活血通經(jīng)、祛瘀止痛、解毒[5]。臨床以二藥為基礎(chǔ)的復(fù)方（活血明目湯、剔絡(luò)化瘀方、祛積通絡(luò)方）治療RVO 效果確切[6-8]，但具體機(jī)制尚不明確。基于此，本研究采用系統(tǒng)生物學(xué)的方法探討桃仁-紅花治療RVO 的作用機(jī)制，供臨床參考。

1 材料與方法

1.1 篩選藥對成分及靶點(diǎn)

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php）分別輸入“桃仁”“紅花”，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 為篩選條件，合并，去重，獲得桃仁-紅花的有效成分及靶點(diǎn)。同時(shí)借助Cytoscape 3.7.2 軟件獲得藥對活性成分。

1.2 篩選交集靶點(diǎn)

在GeneCards（https://www.genecards.org/）平臺(tái)檢索“retinal vein occlusion”，獲得RVO 的潛在靶點(diǎn)。利用Jvenn（http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）平臺(tái)，分別導(dǎo)入藥對和疾病的靶點(diǎn)，獲得交集靶點(diǎn)，并使用STRING（https://string-db.org/）作蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，獲得核心靶點(diǎn)。

1.3 交集靶點(diǎn)的富集分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）平臺(tái)，進(jìn)行GO 分析和KEGG通路富集分析。

1.4 篩選活性成分

借助Cytoscape 3.7.2 軟件整理交集靶點(diǎn)與藥對成分，獲得排名靠前的藥對活性成分，備用。

1.5 分子對接

從PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載活性成分的2D 結(jié)構(gòu)，然后使用Chem3D 對2D 結(jié)構(gòu)加工改造，作為分子對接的配體，在PDB 數(shù)據(jù)庫（http://www1.rcsb.org/）下載核心靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，應(yīng)用Pymol、AutoDockTool 等工具進(jìn)行去水、加氫，作為分子對接的受體，使用AutoDock 軟件對成分及靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，當(dāng)結(jié)合能≤-7 kcal/mol[9]，提示成分與靶點(diǎn)具有較穩(wěn)定的結(jié)合性。

2 結(jié)果

2.1 桃仁-紅花的有效成分

利用TCMSP 平臺(tái)，獲得23 個(gè)桃仁成分，22 個(gè)紅花成分，合并，去重，獲得35 個(gè)藥對成分，178 個(gè)藥對靶點(diǎn)。借助Cytoscape 3.7.2 軟件拓?fù)浞治觯@得排名前10 的活性成分。見表1。

表1 桃仁-紅花的活性成分

2.2 桃仁-紅花和RVO 的潛在靶點(diǎn)

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫，獲得1704 個(gè)RVO 靶點(diǎn)，以“Relevance score”≥3.92（中位數(shù)）篩選，最終獲得853 個(gè)RVO 靶點(diǎn)。與178 個(gè)藥對靶點(diǎn)取交集，獲得96 個(gè)交集靶點(diǎn)，PPI 分析后，排名靠前的核心靶點(diǎn)見圖1。

圖1 桃仁-紅花-視網(wǎng)膜靜脈阻塞的交集靶點(diǎn)

2.3 活性成分

整理藥對成分和交集靶點(diǎn)，借助Cytoscape 3.7.2 軟件，進(jìn)行拓?fù)浞治觯@得排名前10 的活性成分為：槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-胡蘿卜素、黃芩黃素、植物甾醇、豆甾醇、6-羥基山奈酚、赤霉素、常春藤皂苷元。

2.4 GO 分析和KEGG 分析

GO 分析分別獲得246 個(gè)生物過程，61 個(gè)細(xì)胞成分，111 個(gè)分子功能。在246 個(gè)生物學(xué)過程中，主要包括細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路，對脂多糖的反應(yīng)，凋亡信號(hào)通路，對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等；在61 個(gè)細(xì)胞成分中，主要影響膜筏，RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，囊泡腔，細(xì)胞外基質(zhì)等；在111 個(gè)分子功能中，主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，血紅素結(jié)合等。GO 分析中3 個(gè)部分靠前的10 個(gè)序列如圖2 所示。KEGG 分析共獲得150 條通路，包括AGE-RAGE 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路等，摘錄前10 條通路見表2。交集靶點(diǎn)標(biāo)記于糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路圖（http：//www.bioinformatics.com.cn/）如圖3 所示。

圖3 糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE 信號(hào)途徑（灰色方框?yàn)樘胰?紅花作用的靶點(diǎn)）

表2 交集靶點(diǎn)的KEGG 分析

圖2 GO 富集分析圖

2.5 分子對接的結(jié)果

利用AutoDock 軟件，選取排名前3 的活性成分：槲皮素、木犀草素、山柰酚，與交集靶點(diǎn)中排名第一的AKT1 進(jìn)行分子對接，此次對接的結(jié)果AKT1 與槲皮素結(jié)合能為-7.64 kcal/mol、AKT1 與木犀草素結(jié)合能為-7.69 kcal/mol、AKT1 與山柰酚結(jié)合能為-7.21 kcal/mol，提示桃仁-紅花的成分進(jìn)入機(jī)體后，能與靶點(diǎn)很好地結(jié)合。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素、木犀草素、山柰酚等成分可能是桃仁-紅花作用RVO 的活性成分。以往藥理研究[10]，槲皮素通過抑制JNK/P38 MAPK 信號(hào)通路，緩解氧化應(yīng)激下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷，下調(diào)視網(wǎng)膜內(nèi)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、MCP-1 等因子的水平，保護(hù)損傷的ARPE-19 細(xì)胞[11]，同時(shí)抑制高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管的生成[12]。木犀草素通過下調(diào)HMGB1 的水平，減輕對NF-κB 的調(diào)控，減輕炎癥反應(yīng)，抑制RPE 細(xì)胞的凋亡，保護(hù)血-視網(wǎng)膜屏障[13]。山柰酚阻止NF-κB 信號(hào)通路的激活，抑制IL-6、IL-8、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎癥介質(zhì)的釋放[14]，同時(shí)下調(diào)VEGF 和PGF的表達(dá)，阻止人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，減少視網(wǎng)膜新生血管形成。

核心靶點(diǎn)主要涉及ALB、AKT1、IL-6 等。ALB[15]是由肝細(xì)胞合成的一種多肽，當(dāng)體內(nèi)發(fā)生炎癥時(shí)，抑制ALB 合成，同時(shí)消耗ALB，誘發(fā)低蛋白血癥，加劇炎癥反應(yīng)。此外，ALB 是體內(nèi)的抗氧化池[16]，當(dāng)ALB缺乏時(shí)，LDL 被氧化而具有細(xì)胞毒性，刺激單核、巨噬細(xì)胞分泌趨化、黏附因子，增加血液的黏稠度，破壞血管內(nèi)皮[17]，影響血管的通透性。視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞中的Akt1 會(huì)通過調(diào)控Ang-1 信號(hào)通路，維持血管內(nèi)皮的穩(wěn)定性[18]。當(dāng)Akt1 減少，F(xiàn)oxO 介導(dǎo)的緊密連接蛋白會(huì)減少，同時(shí)誘導(dǎo)VEGF 的表達(dá)，破壞血管內(nèi)皮屏障[19]。在RVO 中[20]，IL-6 的濃度與癥狀的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。高濃度的IL-6 會(huì)刺激VEGF 的分泌，誘導(dǎo)新生血管的生成，影響血流動(dòng)力學(xué)。

對交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析，提示桃仁-紅花干預(yù)RVO涉及凋亡信號(hào)通路，對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等生物學(xué)過程。KEGG 分析顯示糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路等是桃仁-紅花治療RVO 的主要通路。糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路是血管氧化應(yīng)激損害的主要機(jī)制[21]，且此損害是不可逆的。AGE 的升高會(huì)破壞血管內(nèi)皮，增加血管通透性[22]，RAGE 為AGE 的受體之一，正常狀態(tài)下含量低，但體內(nèi)發(fā)生各種炎癥時(shí)，濃度快速升高。AGE 與RAGE 結(jié)合，激活RAGE-Nox-NF-κB信號(hào)通路[23]，促進(jìn)VEGF、TGF-β1、MCP-1 等因子的表達(dá)，引發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，破壞血管內(nèi)皮[24]。將本研究的交集靶點(diǎn)標(biāo)記于糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路（http://www.bioinformatics.com.cn/），推測桃仁-紅花干預(yù)RVO 可能與調(diào)控血管生成、血栓形成，改善炎癥有關(guān)。研究顯示，較之空白對照組，BRVO 患者的IL-17 水平顯著升高，IL-17 促進(jìn)VEGF、ICAM-1、IL-6 的分泌，促進(jìn)人視網(wǎng)膜中新生血管的生成[25]。近來研究提出[26]，中醫(yī)的化瘀療法可能類似西醫(yī)的抑制血小板的活化及ICAM-1 等因子的表達(dá)。在阻斷PI3K/Akt 信號(hào)通路后，血小板活化和血栓形成得以抑制，且沒有明顯的出血傾向[27]，證實(shí)了桃仁-紅花的化瘀之效。

綜上，桃仁-紅花通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路相互作用RVO，具體機(jī)制可能為減少血小板的聚集，改善血流動(dòng)力學(xué)，調(diào)節(jié)炎癥因子的水平，抑制氧化應(yīng)激信號(hào)通絡(luò)的激活，延緩血管的損傷，促進(jìn)損傷血管內(nèi)皮的修復(fù)。此研究為進(jìn)一步探討桃仁、紅花等活血化瘀類藥物在治療眼底血管疾病指明了方向。但是臨床辨證施治，往往受到劑型、劑量的影響，故具體考究，還待未來的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。