卵巢癌異種移植動物模型的建立及鑒定研究

李 巍 王 嬌 蘇 莉 苗勁蔚 吳玉梅

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院 北京婦幼保健院婦瘤科，北京 100071

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是婦產(chǎn)科常見的惡性腫瘤之一，其中70%為晚期病例，5 年生存率約為40%[1]，死亡率高居前列。目前雖然婦科腫瘤手術(shù)滿意率有所提升，但上述情況仍未改變[2]。其中的一個重要原因為OC 是異質(zhì)性腫瘤，患者對化療藥物的敏感性存在較大差異，術(shù)后最重要的化療目前為經(jīng)驗性治療，效果有限。傳統(tǒng)的腫瘤藥物敏感性試驗主要基于腫瘤細(xì)胞系模型，但細(xì)胞系有缺乏異質(zhì)性、無法保留腫瘤微環(huán)境、反復(fù)體外傳代容易發(fā)生基因變異等缺點，臨床應(yīng)用效果差。人源腫瘤異種移植（patient-derived tumor xenograft，PDX）模型是將患者的新鮮腫瘤組織接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，可以更好地保留腫瘤組織的異質(zhì)性[3]，模擬患者體內(nèi)狀態(tài)，有助于實現(xiàn)藥物篩選等研究[4-6]。本研究擬構(gòu)建OC 的PDX 模型，經(jīng)整體觀察、組織病理學(xué)、分子生物學(xué)研究，評估PDX 模型構(gòu)建的有效性，為OC 研究提供可靠的臨床前模型[7]。

1 材料與方法

1.1 腫瘤標(biāo)本

收集2017 年7 月至2018 年7 月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院進行手術(shù)治療的10 例OC 患者腫瘤組織，進行PDX 建模研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理確診為OC；②對本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①復(fù)發(fā)OC；②合并其他惡性腫瘤；③免疫系統(tǒng)疾病；④既往行放化療。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審批立項（20160913）。

1.2 實驗動物

實驗動物為雌性非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷（non-obese diabetes/severe combined immunodeficiency，NOD/SCID）小鼠，購自北京華阜康生物科技有限公司，動物使用許可證SYXK（京）2015-0030，實驗動物質(zhì)量合格證號NO.11401300083533，鼠齡6～8 周，體重20～24 g，共150 只。飼養(yǎng)于北京志康博SPF 級實驗動物中心，環(huán)境溫度和相對濕度分別維持在22～26℃和40%～60%，飼料及飲用水均經(jīng)無菌處理。

1.3 腫瘤組織處理及PDX 模型建立

無菌條件下取患者新鮮腫瘤組織（P0 代），置于Hank’s 平衡鹽溶液中冷藏運送；部分新鮮腫瘤組織置于4%中性甲醛溶液中固定，用于石蠟包埋、染色等實驗。

于SPF 實驗動物中心超凈臺上，用Hank’s 平衡鹽溶液反復(fù)清洗新鮮腫瘤組織，剔除壞死和脂肪組織。再將腫瘤組織分割成2 mm3的若干部分。75%酒精消毒小鼠背部皮膚，將移植部位用0.5%利多卡因進行局部浸潤麻醉，利用25 號套管針將腫瘤組織1～2 塊送至小鼠皮下，按壓局部2 min。一份腫瘤組織樣本接種3 只NOD/SCID 小鼠腋背部皮下，共接種30 只。其后觀察小鼠的健康狀態(tài)及移植瘤生長情況，移植瘤穩(wěn)定后逐步增長，若連續(xù)觀察4 個月未成瘤，記為建模失敗。

1.4 腫瘤傳代

用游標(biāo)卡尺檢測移植瘤的生長情況，≥2 次/周，測量腫瘤的長度和寬度。當(dāng)移植瘤體積為500～1000 mm3時為建模成功（記為P1 代），頸椎脫位方法處死小鼠，無菌條件下取出移植瘤，按前述方法移植至下一代NOD/SCID 小鼠（記為P2 代），依此類推，部分直至傳至P4 代。同時各代取部分新鮮腫瘤組織置于4%中性甲醛溶液中固定，用于石蠟包埋、染色等實驗。

1.5 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）分析

患者腫瘤組織及移植瘤組織以4%中性甲醛固定48 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，厚度4～6 μm，行HE 和IHC 染色。IHC 染色，檢查指標(biāo)包括P53（MAB-0674）、Ki67（MAB-0672）、P16（MAB-0673）、WT1（MAB-0678）、Pax8（MAB-0837）、雌激素受體（estrogen receptor，ER）（MAB-0062）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）（MAB-0675）、波形蛋白（MAB-0735），均購自邁新生物科技有限公司。

2 結(jié)果

2.1 接種后NOD/SCID 小鼠狀態(tài)觀察

接種腫瘤組織后NOD/SCID 小鼠活動、精神狀態(tài)、外界反應(yīng)、飲食、大小便情況等大致正常，總體研究過程中，小鼠無明顯不良反應(yīng)。腫瘤組織接種后小鼠體重下降不明顯，7～10 d 后體重緩慢增加。傳代前曾觀察到3 只小鼠體重降低，可能跟其自身的營養(yǎng)狀況稍差、腫瘤負(fù)荷較大等相關(guān)。建模成功后模型外觀見圖1。

圖1 非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠卵巢癌人源異種移植模型外觀（P1～4 代）

2.2 移植瘤及其PDX 模型建立情況

移植瘤接種小鼠后，2～4 周后瘤體逐步長大，8～12 周基本成瘤。4 例患者的標(biāo)本PDX 模型建模成功，成功率為40%。P1～4 代共150 只NOD/SCID 小鼠中成功構(gòu)建卵巢癌模型110 只，其中共接種P1 代NOD/SCID 小鼠30 只，8 只建模成功，成功率為26.6%（8/30）；共接種P2 代NOD/SCID 小鼠24 只，20 只建模成功，成功率為83.3%（20/24）；共接種P3 代NOD/SCID 小鼠60 只，53 只建模成功，成功率為88.3%（53/60）。共接種P4 代NOD/SCID 小鼠36 只，29 只建模成功，成功率為80.1%（29/36）。

2.3 NOD/SCID 小鼠PDX 模型移植瘤病理分析

移植瘤瘤體外觀大致呈球形，質(zhì)地稍硬，包膜多完整，表面可見血管紋理,剖開后切面呈乳白色，囊實性，部分瘤體內(nèi)含黏液，部分瘤體內(nèi)可見液化區(qū)。見圖2。HE 染色后，鏡下可見腺腔樣結(jié)構(gòu)，腺體大小不一，形態(tài)不規(guī)則，間質(zhì)較少，上皮細(xì)胞異型性明顯，核仁明顯，病理性核分裂象多見，與來源人OC 結(jié)構(gòu)及瘤細(xì)胞異型特征基本一致。隨著傳代次數(shù)增加，瘤細(xì)胞分化程度變低，腺樣結(jié)構(gòu)逐漸消失，上皮細(xì)胞分化差，核異型性明顯。見圖3。

圖2 非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠卵巢癌人源異種移植模型移植瘤形態(tài)

圖3 各代非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠卵巢癌人源異種移植模型移植瘤及來源患者腫瘤組織切片（蘇木精-伊紅染色，200×）

2.4 NOD/SCID 小鼠PDX 模型移植瘤IHC 分析

光鏡下，各代移植瘤的形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)均與P1代腫瘤組織高度相似，IHC 染色下ER、PR、P53、P16、Ki67、WT1、Pax8 均呈陽性表達，而波形蛋白呈現(xiàn)陰性表達，與來源患者腫瘤組織高度一致。見圖4。

3 討論

目前國內(nèi)外研究機構(gòu)已在頭頸部腫瘤[8]、食管癌[9]、乳腺癌[10]、胃腸道腫瘤[11]等領(lǐng)域構(gòu)建多個PDX 模型，建模成功率為13%～90%[12]，但在婦科惡性腫瘤領(lǐng)域，尤其是OC 方面，PDX 模型相關(guān)的研究報道較少[13-17]。

以往研究顯示[18]，婦科腫瘤PDX 模型建模成功率較低，為提高PDX 模型成功率，本研究選用了NOD/SCID 小鼠進行建模，該小鼠是NOD 小鼠與SCID 小鼠雜交建立的免疫缺陷小鼠，其T、B 細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞活性缺失，可以接納人血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實體瘤，有利于PDX 模型的建立。但NOD/SCID 小鼠胸腺淋巴瘤發(fā)病率高[19]，胸腺淋巴瘤可能與人類潛在的EB病毒感染有關(guān)，因此，本研究利用NOD/SCID 小鼠進行PDX 模型建模時，有必要對腫瘤的生物學(xué)一致性進行鑒定。

本研究采集10 例OC 患者的新鮮腫瘤組織，皮下接種于NOD/SCID 小鼠，最終4 例患者成功建模，建模成功率為40%。一般模型建立時間為2～3 個月，若4 個月仍未觀察到腫瘤生長，則表示建模失敗[20]。既往研究報道，腫瘤植入部位、小鼠種系、腫瘤病理類型及惡性程度等會影響PDX 模型的成瘤率[21]。本研究中建模的有利條件為卵巢腫瘤組織充足可供嚴(yán)格篩選；NOD/SCID 小鼠免疫耐受性好；手術(shù)醫(yī)師直接取材，可確保腫瘤組織無菌接種；取材、轉(zhuǎn)運至接種時間短（＜1 h）。雖然如此，本研究的Po 代建模成功率僅為40%，提示OC 的PDX 建模成功率不高，與既往研究類似，尚需進一步提升[22]。

本研究也提示OC 的PDX 模型形態(tài)及病理特點與患者臨床病理特點基本一致。為驗證移植瘤生長過程中組織學(xué)形態(tài)及病理特點的一致性情況，本研究對腫瘤組織P1～4 代移植瘤進行IHC 分析，指標(biāo)包含P53、Ki67、P16、WT1、Pax8、ER、PR、波形蛋白。Ki67 代表腫瘤增殖情況，腫瘤惡性程度越高，Ki67 值越高，本研究IHC 分析結(jié)果顯示P1～4 代移植瘤Ki67 均較高。P53 是重要的抑癌基因，參與調(diào)控細(xì)胞周期，在大多數(shù)惡性腫瘤中可被檢測到，P16 也是重要的抑癌基因，其突變及缺失與OC 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[23]。與以往研究類似[24-25]，本研究發(fā)現(xiàn)與Po 代腫瘤組織相似，各代移植瘤均表現(xiàn)出P53 及P16 基因的突變。同時，Pax8 是配對盒基因8 抗體，在OC 組織中有特異性表達，為卵巢原發(fā)腫瘤的典型特征，各代移植瘤均有陽性表達，提示移植瘤模型保留了OC 組織的分子遺傳學(xué)特點。

綜上，本研究成功建立了OC 的PDX 模型，其建立方法可行，接種的腫瘤的生物學(xué)性狀得以穩(wěn)定保留，為進行臨床試驗及OC 相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。