參芎葡萄糖注射液對低灌注大鼠血-腦脊液屏障通透性的影響

馮佩佩 張倩影 黃 炎 李永杰 劉 坤 李 敏

華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河北唐山 063000

血-腦脊液屏障是由脈絡(luò)叢組織上皮細胞間的緊密連接所構(gòu)成，其主要負責(zé)外周血與腦脊液之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運。完整的血-腦脊液屏障結(jié)構(gòu)可有效維持腦組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和正常的生理功能[1]。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，低灌注可增加血-腦脊液屏障的通透性[2-3]。因此，降低低灌注后引起腦缺血群體的血-腦脊液屏障通透性成為近年來的研究熱點。

參芎葡萄糖注射液為一種中西藥復(fù)方制劑，其主要成分為丹參素和鹽酸川芎嗪（人工合成），具有活血化瘀、養(yǎng)血安神的功能，臨床上被廣泛用于治療心肌缺血和冠心病，療效顯著[4]。本文通過研究低灌注大鼠及給予參芎葡萄糖注射液干預(yù)后血-腦脊液屏障通透性的改變，以探討參芎葡萄糖注射液對血-腦脊液屏障保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器

參芎葡萄糖注射液（貴州景峰藥業(yè)有限公司，20180645）；Trizol（美國Invitrogen 公司，10296-010）；兔抗大鼠Occludin 一抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-10011R）；兔抗大鼠ZO-1 一抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-1329R）；山羊抗兔二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-0295G-SA）；白蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（慧嘉生物科技有限公司，201903）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Roche，4897030001）；PCR 試劑盒（Roche，04913850001）。

外科器械（天津市康爾醫(yī)療器械有限公司）；微量加樣器（北京百晶生物技術(shù)有限公司，WH861）；多功能酶標儀（美國分子儀器有限公司，SpectraMax?MS）；超聲勻漿器（美國Sonics，VCX130）；實時熒光定量PCR 儀（Roche，Roche Light Cycler96 型）；激光掃描共聚焦顯微鏡（日本NIKON，C1SI）。

1.2 動物及分組

SPF 級SD 雄性健康大鼠60 只，體重（200±10）g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物的飼養(yǎng)、管理和操作嚴格按照SPF 級大鼠的管理要求進行。動物許可證號：SCXK（京）2014-0004。動物實驗方案已通過華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審核。采用隨機數(shù)字表法將其分為假手術(shù)組、低灌注組、參芎組，每組各20 只，適應(yīng)喂養(yǎng)7 d，術(shù)前禁食12 h。低灌注組與參芎組采用頸總動脈結(jié)扎建立腦缺血模型；40 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉使大鼠充分麻醉；仰臥位將大鼠四肢及牙齒固定，脫毛備皮消毒；頸部正中縱向切口切開皮膚，小心分離右側(cè)頸總動脈，用魚線結(jié)扎，沖洗傷口后縫合，每天消毒傷口，防止術(shù)后感染；假手術(shù)組只暴露頸總動脈不結(jié)扎[5-6]。參芎組每天腹腔注射參芎葡萄糖注射液24 mg/kg。低灌注組及假手術(shù)組腹腔注射等量生理鹽水，共7 d。

1.3 樣本的采集及處理

經(jīng)腹腔麻醉后，大鼠仰臥位固定于操作臺上，打開胸腔，暴露腹主動脈，一次性注射器采血7～9 ml，4℃，2000 r/min 離心10 min，分離血清后置于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｏ绢i部皮膚，使用蝶形針穿刺枕骨大孔，待有落空感時見清亮腦脊液流出，將抽出的腦脊液注入預(yù)冷的EP 管中，-80℃保存。腦脊液收集結(jié)束后將大鼠斷頭取腦。手術(shù)器械分離大鼠側(cè)腦室，提取脈絡(luò)叢組織，隨機取每組4 只大鼠的脈絡(luò)叢放入裝有4%多聚甲醛EP 管中固定，8 只大鼠的脈絡(luò)叢放入裝有Trizol 的EP 管中-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 大鼠血清及腦脊液中白蛋白含量檢測

測定前隨機將各組8 只大鼠血清及腦脊液從冰箱取出在室溫下平衡，ELISA 法檢測血清白蛋白（serum albumin，SAlb）和腦脊液白蛋白（cerebrospinal fluid albumin，CAlb）含量，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，并計算腦脊液及血清白蛋白商值（QAlb=CAlb/SAlb）。

1.5 實時熒光定量PCR 檢測脈絡(luò)叢組織ZO-1 與Occludin 的mRNA

Trizol 提取總RNA，隨后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 進行實時熒光定量PCR 擴增。PCR 條件：95℃下預(yù)變性，95℃變性10 s，60℃退火60 s、72℃延伸90 s，重復(fù)40 個循環(huán)，反應(yīng)總體系為20 μl：Mix 10 μl，正反向引物各0.6 μl，cDNA 模板100 ng，ROX Reference Dye 0.4 μl，無酶雙蒸水至20 μl。凝膠電泳鑒定，PCR 產(chǎn)物，本實驗以GAPDH 為內(nèi)參，實驗重復(fù)3 次，每個樣本均采用3 個復(fù)孔，所得結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行計算。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.6 激光共聚焦方法檢測脈絡(luò)叢組織ZO-1 與Occludin 的熒光強度

將4 只大鼠的脈絡(luò)叢組織迅速浸入4%多聚甲醛內(nèi)固定；磷酸鹽緩沖液漂洗5 min，重復(fù)3 次；在含1% Triton X-100 的磷酸鹽緩沖液中通透20 min，磷酸鹽緩沖液漂洗5 min，重復(fù)3 次；1%BSA（用磷酸鹽緩沖液稀釋）于室溫下封閉1 h；傾去封閉液后按稀釋比（1∶100）加入一抗，一抗稀釋液為含1%BSA 的磷酸鹽緩沖液，4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液漂洗5 min，重復(fù)3 次；隨后滴加熒光素標記的二抗，二抗由磷酸鹽緩沖液稀釋（1∶200），37℃避光孵育1 h；漂洗后于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，488 nm 為激發(fā)波長，525 nm 為發(fā)射波長，物鏡為1000 倍的顯微鏡。應(yīng)用Image J 軟件對獲取的圖像進行ZO-1 與Occludin 熒光強度分析，熒光強度值越大，蛋白表達越高。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠SAlb、CAlb 及QAlb 比較

低灌注組CAlb、QAlb 高于假手術(shù)組，參芎組CAlb、QAlb 低于低灌注組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；低灌注組與假手術(shù)組SAlb 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）；參芎組與低灌注組SAlb 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 三組大鼠CAlb、SAlb 及QAlb 比較（）

表2 三組大鼠CAlb、SAlb 及QAlb 比較（）

注：與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05；與低灌注組比較，bP ＜0.05。CAlb：腦脊液白蛋白；SAlb：血清白蛋白；QAlb：腦脊液及血清白蛋白商值

2.2 三組脈絡(luò)叢組織ZO-1 和Occludin mRNA 表達比較

低灌注組ZO-1、Occludin mRNA 水平低于假手術(shù)組，參芎組緊密連接蛋白ZO-1、Occludin mRNA 高于低灌注組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖1。

圖1 三組脈絡(luò)叢組織ZO-1 和Occludin mRNA 表達比較（n=8）

2.3 三組ZO-1 和Occludin 熒光強度比較

如圖2～3 所示假手術(shù)組ZO-1、Occludin 熒光分布呈連續(xù)線狀環(huán)形分布，熒光強度較強；低灌注組熒光強度減弱，光環(huán)連續(xù)性有缺損，熒光幾近消失；參芎組ZO-1、Occludin 熒光強度增加，連續(xù)性相對完整。低灌注組ZO-1、Occludin 熒光強度低于假手術(shù)組，參芎組ZO-1、Occludin 熒光強度高于低灌注組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表3。

圖2 三組ZO-1 熒光強度變化

圖3 三組Occludin 熒光強度變化

表3 三組ZO-1 和Occludin 熒光強度比較（）

表3 三組ZO-1 和Occludin 熒光強度比較（）

注：與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05；與低灌注組比較，bP ＜0.05

3 討論

脈絡(luò)叢作為血-腦脊液屏障的物質(zhì)基礎(chǔ)，對于維持神經(jīng)中樞系統(tǒng)的平衡有重要作用。脈絡(luò)叢可分泌腦脊液，而腦脊液對腦組織有支持、保護與營養(yǎng)作用，正常生理狀態(tài)下，其成分保持相對穩(wěn)定[7]。但是，在腦組織發(fā)生損傷或疾病時，腦脊液中的一些血源性蛋白分子，如白蛋白（albumin，Alb）的含量會發(fā)生變化。腦脊液中80%以上Alb 來自血液，而SAlb 含量一定程度上是穩(wěn)定的，不受機體組織損傷或者炎癥的影響。由于血-腦脊液屏障的存在，CAlb 含量甚微，當血-腦脊液屏障受到損傷，通透性增大時，Alb 會通過血-腦脊液屏障進入腦脊液中，導(dǎo)致CAlb 大幅度增加，因此QAlb可以作為反映血-腦脊液屏障通透性損傷的指標，且數(shù)值越大損傷越嚴重[8-10]。本研究結(jié)果顯示，低灌注組CAlb、QAlb 高于假手術(shù)組（P ＜0.05），提示低灌注情況下?lián)p傷大鼠血-腦脊液屏障通透性，與魏微等[11]研究結(jié)果一致。參芎組CALB、QAlb 低于低灌注組（P ＜0.05），提示參芎葡萄糖注射液可改善大鼠血-腦脊液屏障通透性。

血-腦脊液屏障的緊密連接主要由Occludin、claudins、JAM，ZO、AJs 及細胞骨架蛋白構(gòu)成，Occludin、claudins、JAM 屬于跨膜蛋白，決定脈絡(luò)叢上皮細胞的基本形態(tài)特征[11-13]。完整的緊密連接結(jié)構(gòu)使相鄰細胞緊密靠攏，組成環(huán)繞細胞的物理屏障，決定對物質(zhì)的通透性。跨膜蛋白由細胞質(zhì)支架蛋白組成，包括ZO-1和Occludin[14-15]。ZO-1 是首個被發(fā)現(xiàn)的緊密連接相關(guān)蛋白[16]。ZO-1 能夠充當細胞內(nèi)支架蛋白。有研究顯示[17-19]，ZO-1 是屏障破壞的標志性蛋白，與血-腦脊液屏障損傷有密切關(guān)聯(lián)。Occludin 是第一個被確定的緊密連接跨膜蛋白，被認為是最重要的、相對特征性強的緊密連接跨膜蛋白[20-21]。ZO-1 是Occludin 和細胞骨架蛋白的橋梁，與Occludin 相互作用調(diào)節(jié)緊密連接屏障，與血-腦脊液屏障通透性有緊密關(guān)系，ZO-1 與Occludin 蛋白下降與血管的通透性增加密切相關(guān)[22-27]。Wu 等[2]研究發(fā)現(xiàn)ZO-1 與Occludin 共同參與缺氧缺血誘導(dǎo)的血-腦脊液屏障通透性增加。這與本實驗研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，低灌注組ZO-1、Occludin mRNA 及熒光強度低于假手術(shù)組（P ＜0.05），提示血-腦脊液屏障完整性遭到破壞，通透性增加。而參芎組ZO-1、Occludin 熒光強度高于低灌注組（P ＜0.05），提示參芎葡萄糖注射液可增加ZO-1 和Occludin mRNA 表達及分布，通透性降低，保護血-腦脊液屏障。

綜上所述，低灌注狀態(tài)引起的缺血可導(dǎo)致大鼠血-腦脊液屏障通透性增加，而參芎葡萄糖注射液可改善這一損傷，在一定程度上對血-腦脊液屏障有保護作用。本研究結(jié)果將為臨床上低灌注相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。