高通量測序技術在確認病原微生物中存在的問題與挑戰*

趙建玉，周倩倩，魯辛辛，胡繼紅

(1.首都醫科大學附屬北京同仁醫院檢驗科，北京100730；2.北京醫院 國家老年醫學中心 國家衛生健康委臨床檢驗中心，北京100730)

1998年首次提出宏基因組的概念[1]，2000年，宏基因組學的應用從環境拓展到臨床。宏基因組二代測序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)技術通量高，一次能對幾十萬到幾百萬條核酸序列測序，可無偏倚檢測標本中所有的微生物種類，生物信息學分析后可從結果中獲得與感染相關的病原微生物信息[2]。測序成本的指數級下降推動了mNGS技術的臨床開展[3]。2019年底，mNGS對新型冠狀病毒的快速確認在認知突發的疫情中發揮了重要作用。盡管傳統病原學診斷技術不斷發展，但仍有近50%的感染病原不明。mNGS測序技術為不明原因的疑難重癥、新發、突發病原體的鑒定提供了新的選擇，成為臨床實驗室的重要技術補充。雖然mNGS在感染性疾病的診斷中凸顯出巨大優勢與潛力，但該技術從研究走向臨床仍面臨諸多挑戰。

1 mNGS的臨床應用

1.1感染性疾病的診斷與鑒別診斷 傳統微生物鑒定方法(培養、免疫學方法、PCR)一次只能檢測一種或有限的病原微生物，mNGS針對臨床標本中所有核酸物質，包括DNA和/或RNA，無偏倚檢測病毒、細菌、真菌和寄生蟲等[4]，主要用于中樞神經系統、呼吸系統和循環系統感染性疾病的診斷與鑒別診斷[5]。研究表明，mNGS可有效幫助臨床醫生排除活動性中樞神經系統感染[6]，快速鑒定出新型經蜱傳播的Powassan病毒[7]，還可明確病原微生物與疾病之間的新型因果關系[8]，診斷結核性肝膿腫[9]及免疫缺陷患者的混合感染[10]等。此外，對測序數據進行二次分析還可獲得系統發育譜系[11-12]、耐藥性預測及確定耐藥基因等遺傳信息[13]。

1.2微生物種群與疾病的關系 利用mNGS對微生物種群及其可能參與的急慢性病進行研究，促進了益生菌的開發利用，可用于治療艱難梭菌的感染[14]，并證明對孕期母體及胎兒有益[15]。同時，越來越多的研究顯示微生物種群的組成與多種疾病相關，如克羅恩病[16]、結直腸癌[17]、2型糖尿病[18-19]、壞死性小腸結腸炎[20]、肥胖癥[21]和孤獨癥[22]等。宏基因組學技術將成為研究微生物群落與人體健康關系的重要手段。

1.3轉錄組學分析的優勢 RNA的表達通常與微生物轉錄活性有關，檢測RNA可能有助于區分感染與定植[23]或病原微生物的存活與死亡[24]。分析人類宿主的轉錄組學可增強對宿主-微生物相互作用的認識，尤其在病原微生物短暫存在時，根據人類特異性宿主免疫反應間接診斷，可能會提高 “窗口期”檢測的敏感性，如萊姆病[25]或某些蟲媒病毒感染等。還可根據宿主RNA對活動性結核病作出預測[26]。疾病的診斷與鑒別診斷是特異性宿主轉錄組學分析的另一個發展方向，一項研究表明，同時評估呼吸道病原微生物、呼吸道微生物種群和宿主轉錄組可使下呼吸道感染的陰性預測值達到100%[23]。

2 確認病原微生物的問題與挑戰

受測序靈敏度、取樣及病程變化、實驗室檢測能力及生物信息學分析水平的影響，mNGS陽性或陰性結果不能作為臨床診療決策的唯一依據，結果的準確性與標本處理、文庫制備、上機測序及生信分析的任一個環節的質量控制密切相關。mNGS結果判讀應結合臨床與微生物專業知識。

2.1標本質量

2.1.1采樣時機 通常認為癥狀超過1個月的亞急性和慢性感染者可在較長時間內獲取含有微生物核酸的標本，如感染鉤端螺旋體4個月[27]、患囊蟲病1年[28]，mNGS檢測仍可陽性。但急性感染病毒(如西尼羅河病毒)僅在發病的最初幾小時或幾天出現在腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)中[29]，錯過急性期可能造成假陰性。此外，采樣前使用抗菌藥物也可造成假陰性。因此，應盡可能在急性期采集標本送檢mNGS，若未能在急性期取得標本，應謹慎解釋假陰性結果。

2.1.2標本采集 標本采集應無菌操作,防止污染造成假陽性結果，如腰椎穿刺獲得的CSF標本、持針器肘靜脈采集的血液標本可能會受到正常皮膚微生物的污染[30]，溶血性CSF使RNA病毒檢測的敏感性降低[31]等。理想情況下，應優先選擇經過驗證的、不含DNA/RNA的采集容器。嚴格遵守標本采集原則對降低污染風險至關重要。

2.1.3轉運和存儲 標本的轉運和存儲同樣會影響檢測結果。血清或CSF標本在室溫或4 ℃保存數天，RNA降解可使mNGS產生假陰性結果。金屬離子螯合劑EDTA可抑制核酸酶和蛋白酶活性，使核酸穩定性增強，因此應盡量取新鮮標本立即送檢，如需延遲處理，EDTA抗凝血液或血漿比血清更可取[32]。

老年重癥肺炎（CAP）是引起老年患者呼吸衰竭的主要原因之一[1]，目前，臨床上主要采取機械通氣（MV）等方法支持呼吸。MV是搶救呼吸衰竭患者的重要手段，能夠維持患者的SPO2水平。但治療期間容易引起肺實質感染性炎癥，即呼吸機相關性肺炎（VAP）[2]。VAP是一種嚴重的院內感染，主要發生于機械通氣治療2 d 后及停機撥管后2 d內，不僅會加重患者病情，同時還會嚴重威脅患者生命安全。有報道稱，積極、有效的護理干預能夠提升CAP并發VAP患者的治療效果，改善其預后。因此，本文對老年CAP并發VAP患者加強護理干預，并觀察其對患者治療效果的影響，現報道如下。

2.2核酸含量及質量

2.2.1核酸含量 mNGS是一種直接核酸檢測方法，通過回收基因組DNA或RNA鑒定病原微生物。如果標本中不包含病原微生物核酸或核酸含量較低，則可產生假陰性結果，如局限性腦膿腫、一過性感染或低滴度(<100個拷貝)感染等。急性傳染病精確診斷(The Precision Diagnosis of Acute Infectious Diseases，PDAID)的一項研究表明，與傳統檢測方法相比，58例明確診斷為神經系統感染的患者中有26例(45%)mNGS檢測結果為假陰性，其中11例通過血清學診斷(如西尼羅河病毒)，7例為局限性腦膿腫，6例序列數低于報告閾值，2例未檢測到病原微生物核酸[11]。

2.2.2核酸提取方法 mNGS技術的準確性依賴于不同類別微生物核酸的提取效率。不同微生物細胞壁組成不同，核酸提取效率不同，如真菌、分枝桿菌細胞壁較厚，若不使用特殊的破壁處理方法，較低的核酸提取效率會產生假陰性結果。

2.2.3人源核酸去除與富集 低豐度病原微生物須進行核酸富集或宿主核酸去除，去除效率過低或過高均可能降低檢測靈敏度，產生假陰性結果。目前，已開發出多種制備RNA文庫的人源核酸的去除方法，如利用DNase Ⅰ去除人源DNA[33]，抗人源線粒體和核糖體RNA抗體可去除標本中50%～80%的人源核酸[34]，但當病原微生物核酸含量極低時作用甚微，額外添加試劑還可能增加外源背景污染[35]，尚無針對DNA文庫的有效去除與富集辦法。市售的DNA富集試劑盒富集效率有限，如NEBNext微生物DNA富集試劑盒(美國紐英倫生物技術公司)和MolYsis Basic試劑盒(德國Molzym公司)[33]。另外，有研究表明利用非離子表面活性劑預處理標本，可使人源細胞裂解而保留和富集具有細胞壁的微生物(如細菌和真菌)，然后用DNase Ⅰ降解背景DNA，可使微生物核酸達到1 000倍以上富集[33]。但無細胞壁的病原微生物(如支原體或寄生蟲)可能也會在預處理階段被去除，造成假陰性結果。因此，去除人源核酸的方法選擇需結合臨床檢測目的。

2.3測序方案

2.3.1測序策略 mNGS測序策略包括DNA和/或RNA測序，不同測序策略會影響某些病原微生物檢測結果的準確性。在擬診基礎上，深入了解各種測序策略適應癥對臨床醫生選擇合適的檢測項目具有重要意義。DNA測序可檢測除RNA病毒以外的病原微生物，RNA測序除可檢測RNA病毒、反映病原微生物轉錄活性外，還可對轉錄組學及宿主特異性免疫反應作進一步分析。因此，若臨床已排除病毒感染，可直接進行DNA測序。當懷疑病毒感染，尤其是呼吸道、血液、CSF標本，或臨床表現復雜、無特定懷疑方向時，應同時進行DNA和RNA測序。如果僅進行DNA測序可能會造成假陰性。

2.4生物信息學分析

2.4.1序列質量 一次高通量測序可產生數千萬條短序列，得到下機數據后，首先應進行質量評估以保證序列可用性。評估指標包括Q20占比、接頭污染比例、有效序列長度及數據的有效比對率等。如果下機序列未進行質量評估，測序接頭、低質量序列(如Q20質量堿基比例少于30%的序列)、低復雜度序列及重復序列未能有效去除，將無法保障作為微生物鑒定的輸入序列的質量，無法保證結果準確性。

2.4.2人源序列 mNGS檢測靈敏度與下機數據中人源序列含量有關。標本類型不同，人源序列占下機總序列的比例不同，如腦膜炎患者CSF中97%～99%的序列可能是人源序列[23]。如果宿主產生較強的免疫反應，標本中白細胞升高，病原微生物的相對序列數將進一步降低。生物信息分析時若能有效去除人源序列，將提高微生物檢測的分析靈敏度。這就要求用于人源序列比對的數據庫盡可能完整，應至少包括人基因組、轉錄組、線粒體、核糖體等序列。如果人源數據庫不完整，人源序列去除不充分，將對后續微生物序列的比對與分析產生較大干擾。

2.4.3微生物數據庫 多數測序公司選擇NCBI數據庫進行微生物序列比對，該數據庫包含來自全球所有已知生物的基因組序列，數據庫龐大，部分基因組草圖或序列包含錯誤信息，可能會使標本的低質量讀數(即計算噪聲)與錯誤注釋的序列或數據庫條目中的污染序列相匹配而導致假陽性結果。與NCBI比對的序列，如有必要需進行二次驗證。高精度的數據庫(如FDA Reference Viral Database，RVDB[38])包含已知病原微生物的高質量基因組信息，可減少微生物匹配錯誤的可能性，但未包含在該數據庫中的病原微生物可能會因匹配不到而產生假陰性。應鼓勵有實力的實驗室根據我國感染性疾病特點自建數據庫。

2.4.4污染菌 對過濾后的數據進行微生物鑒定，首先應確定致病菌(一種或多種)與污染物(如皮膚正常菌群或實驗室與試劑中的污染物)的比例。有研究表明，在常用的DNA提取試劑及其他試劑中，外源DNA普遍存在，嚴重影響結果判讀，特別是微生物含量低的標本[39]。為最大限度減少低水平微生物污染導致的假陽性結果，可建立檢測閾值標準，如CSF中某些代表性微生物的檢出下限為0.16 CFU/mL，若病原微生物豐度低于檢測限將產生假陰性結果[31]。生物信息分析應結合臨床，否則可能會漏掉或錯報重要病原微生物。

2.5標準化

2.5.1缺乏參考標準及質控品 大多數可用的標準品都是針對特定應用高度定制的，如Zymo BIOMICS微生物種群標準品(ZymoBIOMICS Microbial Community Standard)，主要用于微生物種群及細菌和真菌宏基因組學分析[38]。美國國家標準與技術研究所(the National Institute of Standards and Technology，NIST)的標準品只包含細菌。當前，實驗室多自建質控品，利用“無模板”(即無菌水)或標本采集過程中的皮膚正常微生物菌群、試劑及實驗室中的污染菌等構建背景污染菌模型。但由于缺乏通用的參考標準和質控品，無法確保mNGS分析的質量及穩定性，無法比較不同實驗室間的檢測性能。

2.5.2缺乏標準化的工作流程 目前，尚無針對mNGS的標準化程序，尚無 FDA批準的用于感染性疾病診斷的mNGS方法。各實驗室工作流程高度個性化[40]，從樣品制備、試劑選擇、測序過程到最終的生物信息分析管道等關鍵的工作流程不盡相同，缺乏標準化和方法驗證，無法評估不同實驗室結果，無法保證測序的準確性。

2.6確認實驗 由于不同類型微生物基因組長度和測序平臺存在差異，無法針對所有微生物建立統一的陰陽性判讀標準[41]，臨床應對mNGS的結果持謹慎態度。mNGS陽性不一定是病原體陽性，需要第二種方法或標志物驗證；如是病原體陽性，也不一定都是致病菌，必須結合臨床進行解釋，必要時可與微生物學和分子生物學等專家共同研討。在臨床標本中發現非典型或新型病原微生物時應進行確認實驗，如正交試驗、血清學及特異性核酸擴增等，如有必要還應進行細胞培養或動物模型試驗加以驗證。

2.7其他挑戰 盡管宏基因組學快速發展，但在臨床實驗室開展該技術仍然問題諸多。高成本、非醫保仍是開展mNGS的主要障礙。實驗室面臨的主要問題是缺少臨床應用及標準化操作的專家共識或指南、缺乏通用參考標準及驗證方法、缺乏規范化的檢測體系及全過程質量控制；絕大多數提供報告的檢測實驗室無資質，未認可；針對檢測到的微生物，無法明確是致病菌、定植菌還是污染菌；新的研究成果如何實時轉變為臨床所用等。

3 展望

3.1推動mNGS在臨床實驗室的認證 國外一家臨床微生物實驗室已成功開發并驗證了一種用于神經系統感染性疾病的mNGS檢測方法，可從CSF中全面檢測與腦膜炎和腦炎相關的病原微生物，并獲得了臨床實驗室改進法案修正案(Clinical Laboratory Improvement Amendments，CLIA)認證[42]。此實驗室正在對檢測其他標本及感染類型的mNGS進行臨床性能驗證，這將推動mNGS的臨床實施并為其他實驗室提供參考。在未來，隨著參考品和質控品的研發、共識及指南的出現以及更多標準化mNGS平臺的建立，不同實驗室間的評估及驗證將得以實現，測序結果將更加精準。

3.2方法學優化 試劑盒及環境中的污染物不易去除，準確識別污染物對于mNGS結果解釋至關重要，已有研究通過檢測質控品鑒別出試劑和實驗室環境中的常見污染菌并提出了相關指南[35]。以此建立基準數據庫，如腦膜炎和眼內炎的常見污染微生物數據庫[43-44]，有利于消除正常微生物種群和環境污染物的干擾并提高結果的準確性[45]。另外，有一些研究開發統計模型確定mNGS產生數據的優先次序，對鑒定的微生物進行排序，簡化結果判讀(例如Z分數算法)[45-46]。

3.3軟硬件創新 新一代測序儀(如Illumina NovaSeq儀器)的輸出量大大提高。機器人批量處理標本將顯著提高實驗室自動化程度。微流控設備(如VolTRAX116)將使mNGS在床旁檢驗(point-of-care testing,POCT)領域得以開發利用[47]。無需PCR即可測定無限長度的核酸序列的第三代單分子測序技術，可直接檢測到甲基化，同步表觀遺傳學分析等[48]。此外，編程人員正在不斷開發、驗證和維護供臨床使用的生物信息學管道，軟件開發人員不斷更新生物信息學分析的各種算法。文庫制備方法、序列生成和生物信息學方面的技術進步正以更低的成本實現更快、更全面的宏基因組分析，相信在臨床實驗室專家、醫生、制造商、平臺和軟件開發人員、生物信息學家及統計學家等多學科的深入合作下，mNGS應用之路會越走越遠[49]。

4 小結

mNGS除用于感染性疾病的診斷外，還可用于種群分析、轉錄組學分析等，但在其他領域的應用依舊緩慢，多數尚未納入常規臨床實踐。盡管mNGS仍不可能取代傳統方法，但在某些情況下mNGS作為一種補充技術必不可少。隨著測序技術的快速發展，預測幾年內mNGS的檢測速度和準確性將得到顯著提高?？傊?，mNGS技術不斷發展成熟，有望成為一種快速、可靠的病原微生物鑒定手段，并在不久的將來廣泛應用于臨床。