宏基因組二代測序技術(shù)在臨床病原學(xué)診斷中的應(yīng)用*

戴媛媛，馬筱玲

(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，合肥 230000)

臨床病原學(xué)診斷的常規(guī)方法有鏡檢、培養(yǎng)、抗原/抗體檢測和核酸檢測。依賴傳統(tǒng)方法約有25%～60%的感染性疾病病原體不能明確診斷[1-5]。二代測序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)是相對于一代測序技術(shù)而言的新型測序方法[6]，可以同時測定幾百萬甚至上億條核酸序列，其優(yōu)勢是通量高、敏感性高。在微生物檢測中，NGS技術(shù)可用于宏基因組測序、全基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序、目標(biāo)基因測序等。宏基因組二代測序(metagenome next-generation sequencing，mNGS)技術(shù)指采用NGS技術(shù)對特定標(biāo)本中所有核酸序列進(jìn)行測序。本文重點討論mNGS技術(shù)在臨床病原學(xué)診斷中的應(yīng)用。

1 mNGS在病原體檢測中的應(yīng)用

mNGS能全覆蓋檢測細(xì)菌、支原體、衣原體、螺旋體、立克次體、真菌、病毒和寄生蟲等所有病原體[7-10]。與傳統(tǒng)方法比較，mNGS在病原體檢測方面有如下優(yōu)勢。

1.1檢測新發(fā)未知病原體 近年來，不同病毒間的交叉重組、重配所導(dǎo)致的新發(fā)傳染病暴發(fā)越來越頻繁。傳統(tǒng)PCR檢測技術(shù)的瓶頸是需要根據(jù)已知病原體序列信息預(yù)先設(shè)計引物，而mNGS能夠?qū)εR床樣本中的所有核酸序列進(jìn)行無偏倚測序，能快速鑒定新發(fā)病原體。如2019年12月15日在中國武漢出現(xiàn)不明原因肺炎患者，就是使用mNGS迅速在患者肺泡灌洗液標(biāo)本中檢出冠狀病毒，并完成全基因組測序[11-12]。據(jù)此，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)于2020年1月12日命名該病毒為新型冠狀病毒(2019-nCoV)[13]。由此可見，mNGS在2019-nCoV的發(fā)現(xiàn)和鑒定中發(fā)揮重要作用。

1.2檢測罕見病原體 罕見病原體感染是臨床非常棘手的難題，由于常規(guī)檢測方法不能覆蓋，往往導(dǎo)致誤診或漏診。2014年Wilson等[14]報道一名14歲的男孩，持續(xù)發(fā)熱和頭痛，繼而進(jìn)展為腦積水和癲癇，在4個月的時間里3次到醫(yī)療機(jī)構(gòu)就診，做了包括腦組織活檢在內(nèi)的38項病原學(xué)檢查，均未發(fā)現(xiàn)病原體，最終運用mNGS技術(shù)診斷為鉤端螺旋體腦膜炎。2015年，Wilson等[15]利用mNGS診斷1例巴氏阿米巴導(dǎo)致的腦膜炎。隨后有多例利用mNGS檢出罕見病原體的報道：如Mai等[16]在16歲腦炎男孩的尿液中檢出日本腦炎病毒；Fung等[17]在異基因造血干細(xì)胞移植患者血液中檢出沙眼衣原體；Du等[18]在11歲女孩的呼吸道標(biāo)本中檢出西尼羅河病毒等。以上研究表明，mNGS技術(shù)極大地增強(qiáng)了罕見病原體的檢出能力，是感染性疾病診斷領(lǐng)域的一次革新和飛躍。

1.3檢測跨物種傳播病原體 隨著全球化進(jìn)程，曾經(jīng)局限于小范圍、特定物種的病原體越來越多地發(fā)生跨地域、跨物種傳播。mNGS可揭示先前無法區(qū)分的動物來源和人類來源病原體的差異，可追蹤潛在的人獸共患疾病起源[19]。如Sachsenr?der等[20]使用mNGS檢測了野生老鼠的腸道標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)標(biāo)本中有博卡病毒、沙波病毒、諾如病毒和輪狀病毒等多種病原體，其中輪狀病毒A株的序列與人類致病密切相關(guān)。Ai等[21]通過mNGS診斷了一名女性因直接接觸豬的污染物而感染豬皰疹病毒導(dǎo)致眼內(nèi)炎。

1.4檢測混合感染病原體 傳統(tǒng)微生物檢驗具有偏向性，只能檢出部分病原體，而mNGS可無偏向性地同時檢出所有感染的病原體，為患者明確診斷節(jié)省了時間。顧鵬等[22]報道，對37例使用免疫抑制劑的感染患者使用mNGS檢測，發(fā)現(xiàn)有31例是混合感染，病原體包括肺孢子菌、巨細(xì)胞病毒、皰疹病毒、細(xì)環(huán)病毒和細(xì)菌等。

1.5檢測培養(yǎng)陰性的細(xì)菌/真菌性病原體 針對細(xì)菌和真菌感染，公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”檢測方法是培養(yǎng)，但由于抗菌藥物的應(yīng)用、標(biāo)本運送不及時、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件選擇不正確等因素可能導(dǎo)致培養(yǎng)陰性。Yao等[23]報道使用mNGS在3例常規(guī)培養(yǎng)陰性的腦脊液中檢出產(chǎn)單核李斯特菌。Dai等[24]報道在1例2次血培養(yǎng)陰性的患者血液標(biāo)本中檢出豬鏈球菌。此外，某些細(xì)菌/真菌用常規(guī)方法難以培養(yǎng)或不能培養(yǎng)，也可以通過mNGS進(jìn)行檢測，如軍團(tuán)菌[25]、肺孢子菌[26]等。

2 mNGS在感染性疾病診斷中的應(yīng)用

從成本效益考慮，輕癥感染以及使用傳統(tǒng)檢測方法能夠明確診斷的感染，如尿路感染、皮膚軟組織感染，不推薦使用mNGS檢測。從技術(shù)本身的局限性考慮，人源性細(xì)胞較多或背景菌較多的感染標(biāo)本，如糞便標(biāo)本，不推薦使用mNGS檢測。mNGS技術(shù)的主要臨床適應(yīng)癥如下。

2.1重癥感染的診斷 臨床常見的重癥感染有膿毒癥、腦炎/腦膜炎、重癥肺炎等。對于這些感染，mNGS技術(shù)有較高的臨床應(yīng)用價值，能夠快速、精準(zhǔn)地找到病原體。Crumaz等[27]通過對比健康志愿者與膿毒癥患者的mNGS測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在膿毒癥患者血液標(biāo)本中病原菌指數(shù)絕對值、豐度顯著升高，且其變化與治療效果密切相關(guān)；斯坦福大學(xué)急診醫(yī)學(xué)中心納入580例臨床診斷為膿毒癥的患者，驗證血漿中游離DNA用于病原測序檢測診斷效能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mNGS對膿毒癥病原學(xué)診斷陽性率遠(yuǎn)高于培養(yǎng)(48.6% vs 18.1%)，有超過85%的mNGS檢測第2天可報告結(jié)果，有53.7%的報告檢出超過1種以上的微生物[28]；Xie等[29]研究發(fā)現(xiàn)mNGS可以早期確定重癥肺炎患者的病原體，指導(dǎo)抗菌藥物的應(yīng)用，改善重癥肺炎患者的病死率。關(guān)鴻志教授團(tuán)隊?wèi)?yīng)用mNGS在腦脊液中檢出人皰疹病毒[30]、新型隱球菌[31]、布魯菌[32]等多種病原體。

2.2慢性感染的診斷 慢性感染通常反復(fù)發(fā)作，較難治愈。由于慢性感染的癥狀不典型，機(jī)體間斷性排菌，臨床實驗室檢測困難。Wilson教授借助mNGS診斷1例患有慢性復(fù)發(fā)性腦膜炎16年的患者，發(fā)現(xiàn)其病原體為豬帶絳蟲，后續(xù)血清學(xué)實驗也支持其診斷[33]。Huang等[34]利用mNGS診斷1例慢性骨關(guān)節(jié)結(jié)核感染。

2.3疑難復(fù)雜感染的診斷 因mNGS檢測無偏倚性和全覆蓋性，對疑難感染病例診斷具有重要作用。如1例非洲務(wù)工回國人員出現(xiàn)反復(fù)發(fā)熱、頭痛、嗜睡，華山醫(yī)院張文宏團(tuán)隊用mNGS技術(shù)對其腦脊液進(jìn)行檢測，最終確診為錐蟲病，給予針對性治療后患者痊愈出院[35]；深圳市第三人民醫(yī)院用mNGS確診了1例罕見阿米巴腦炎[36]。

2.4免疫缺陷患者感染的診斷 免疫缺陷患者容易發(fā)生機(jī)會致病菌感染和混合感染，而且感染的病原體復(fù)雜多樣，診斷困難。Wang等[37]對108例免疫抑制患者的臨床標(biāo)本進(jìn)行mNGS檢測，該技術(shù)顯示出良好的診斷潛力，不受免疫抑制程度的影響，指導(dǎo)抗菌藥物治療的成功率顯著高于經(jīng)驗用藥組(81.8% vs 52.6%)。Ye等[38]報道1名2歲粒單細(xì)胞白血病患兒干細(xì)胞移植后出現(xiàn)嚴(yán)重的皮疹和高熱，細(xì)菌培養(yǎng)和PCR均未檢測出病原體，利用mNGS檢測血液標(biāo)本后發(fā)現(xiàn)痤瘡丙酸桿菌是其感染的病原菌，進(jìn)行針對性治療后病情好轉(zhuǎn)。Parize等[39]報道一項多中心前瞻性研究，應(yīng)用mNGS檢測免疫缺陷患者的鼻咽拭子、穿刺液及血液等標(biāo)本，結(jié)果顯示mNGS較傳統(tǒng)培養(yǎng)法有較高的檢出率(36% vs 11%)，有更高的陰性預(yù)測值(98.4%)。

3 mNGS檢測影響因素及結(jié)果判讀

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，測序本身不再是瓶頸，關(guān)鍵是分析前和分析后質(zhì)量控制以及檢驗人員和臨床醫(yī)師對mNGS檢測影響因素的了解和對檢測結(jié)果的合理應(yīng)用。

3.1mNGS檢測靈敏度及影響因素 mNGS檢測靈敏度是指單位體積標(biāo)本中檢測到1條病原體序列所需要的病原體個數(shù)。需要的病原體個數(shù)越少，則靈敏度越高。mNGS檢測靈敏度與測序數(shù)據(jù)量(檢測總序列數(shù))及致病微生物基因組的堿基數(shù)呈正相關(guān)，與單位體積標(biāo)本中人源細(xì)胞含量及背景微生物基因數(shù)呈負(fù)相關(guān)。所以，提高mNGS靈敏度的有效方法是增加測序數(shù)據(jù)量、采取適當(dāng)?shù)姆椒ㄈコ嗽葱约?xì)胞、嚴(yán)格控制標(biāo)本質(zhì)量、減少環(huán)境和試劑中的背景微生物等。在測序數(shù)據(jù)量確定的情況下，以下因素可影響mNGS檢測靈敏度。

(1)病原體基因組越大，mNGS檢測靈敏度越高。病原體基因組由大到小的順序是：寄生蟲>真菌>細(xì)菌>病毒。

(2)mNGS檢測的是細(xì)胞外游離DNA(cell free DNA,cfDNA)，胞內(nèi)寄生病原體(如布魯菌、傷寒沙門菌等)因其胞外cfDNA較少，檢測靈敏度較低[6]。

(3)細(xì)胞壁厚的細(xì)菌，如新型隱球菌、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)，難以破壁，核酸提取效率低，mNGS檢測靈敏度低。標(biāo)本中不同病原體核酸提取效率由高到低的順序是：病毒>革蘭陰性細(xì)菌>革蘭陽性細(xì)菌>真菌、MTB。

(4)常規(guī)的DNA宏基因組測序方法不能檢測RNA病毒，如果懷疑RNA病毒(如乙型腦炎病毒、流感病毒、輪狀病毒、冠狀病毒等)感染要采用宏轉(zhuǎn)錄組測序。與來自細(xì)菌和宿主的RNA相比，RNA病毒遺傳物質(zhì)的豐度相對較低且容易降解，因此，mNGS對RNA病毒的檢測靈敏度較低。

(5)臨床標(biāo)本中人源細(xì)胞占比越高，mNGS檢測靈敏度越低。一般而言，人源細(xì)胞占比由少到多的順序是：腦脊液<肺泡灌洗液<血漿<痰液<胸腹水。即使是同一種類型的標(biāo)本，若來源于不同個體，或來源于同一個體不同取材方法或不同取材時間，人源性細(xì)胞的比例都會相差幾個數(shù)量級。有些標(biāo)本如糞便、壞死組織等，因背景太雜，在目前的技術(shù)背景下不適合做mNGS檢測。

(6)臨床標(biāo)本中背景微生物占比越高，mNGS檢測靈敏度越低。背景微生物主要由定植和污染微生物組成，其中定植微生物指能在人體一定部位定居、生長和繁殖的微生物。背景微生物不僅影響mNGS的結(jié)果，對傳統(tǒng)病原學(xué)檢測結(jié)果也有影響。由于mNGS檢測靈敏性高，可在原本認(rèn)為無菌的部位檢出微生物序列，如健康人血液，因此，需通過大數(shù)據(jù)分析，建立不同類型標(biāo)本的背景微生物庫，定期更新，并設(shè)立基線，解讀規(guī)則，以區(qū)分致病微生物和定植微生物。污染微生物指在標(biāo)本取材或?qū)嶒炇覚z測過程中混入的環(huán)境微生物，可通過規(guī)范取材方法、設(shè)置陰性對照等方法減少和識別污染微生物。

3.2微生物種類與結(jié)果判讀 mNGS檢測具有無偏向性和超靈敏性的特點，即使針對無菌部位的標(biāo)本，一次檢測也可以匹配到多種微生物的序列。需要根據(jù)檢測的微生物種類、序列數(shù)(reads)、參考疑似背景微生物庫、陰性對照、臨床特征進(jìn)行綜合判讀。

(1)檢出明確的致病菌，如MTB、諾卡菌、流感病毒、新冠病毒、曲霉、新型隱球菌等，即使序列數(shù)較低也可能是致病性病原體。(2)檢出條件致病菌，如銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、鏈球菌等，需要結(jié)合標(biāo)本類型、序列數(shù)、微生物排名、動態(tài)變化及臨床診斷綜合判斷。(3)檢出常見呼吸道定植菌和皮膚定植菌，如草綠色鏈球菌、干燥奈瑟菌、白念珠菌、痤瘡丙酸桿菌，一般不考慮為致病微生物，除非序列數(shù)特別高，并與臨床癥狀吻合。(4)檢出罕見特殊病原體，如炭疽芽胞桿菌，當(dāng)癥狀、體征與臨床認(rèn)知不符時，可使用Sanger測序、PCR方法或結(jié)合抗原/抗體檢測進(jìn)一步驗證。

3.3mNGS檢測序列數(shù)與結(jié)果判讀 序列數(shù)指匹配到該病原體的序列數(shù)目。序列數(shù)的多少與標(biāo)本中病原體含量多少、病原體基因組大小、標(biāo)本中核酸提取量呈正相關(guān)，而與標(biāo)本中人源序列比例呈負(fù)相關(guān)。不同的病原體具有不同的序列數(shù)特點，要結(jié)合病原體的種類、序列數(shù)目、病原體排位等信息對每個病原體逐個分析，進(jìn)行報告。

(1)一般細(xì)菌：mNGS檢測到某種細(xì)菌(種水平)的序列數(shù)是其余所有細(xì)菌的10倍以上，有臨床意義[40]。

(2)真菌：mNGS檢測到真菌(種水平)的序列數(shù)是其余所有真菌的5倍以上，有臨床意義[41-42]。

(3)MTB：為明確致病菌，環(huán)境污染的可能小。此外，因MTB為胞內(nèi)致病菌，細(xì)胞外游離DNA少，且MTB核酸提取效率低，mNGS只要檢測到1條屬水平的MTB復(fù)合群序列，且能排除其他標(biāo)本攜帶污染，就有臨床意義[43-44]。

(4)非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculosis mycobacteria, NTM)：NTM可能是環(huán)境中污染菌，若檢出，需結(jié)合背景微生物庫和mNGS原始細(xì)菌列表進(jìn)行結(jié)果判讀。若排除污染后屬水平或種水平序列數(shù)排名前十，則有臨床意義[45-46]。

4 存在的問題及展望

mNGS能無偏倚性檢測各種病原體，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法的不足，在感染性疾病的診斷中顯示出巨大的臨床應(yīng)用價值，已被多個指南和共識推薦[47-55]。目前，mNGS臨床應(yīng)用仍面臨一些問題，需要不斷完善，如：標(biāo)本的采集、核酸提取、基因文庫構(gòu)建、試劑選擇、測序數(shù)據(jù)量和生物信息分析(參考數(shù)據(jù)庫和數(shù)據(jù)算法)等缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，測序過程和測序結(jié)果沒有質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)；標(biāo)本前處理操作復(fù)雜繁瑣，涉及多次轉(zhuǎn)管和移液操作，費時較長，容易出現(xiàn)操作失誤和樣本污染；mNGS能檢測到某些耐藥基因和毒力基因，但由于測序深度不夠，尚不能檢測所有的耐藥和毒力基因，也不能確定檢出的耐藥基因/毒力基因與感染菌的相關(guān)性，存在較高的假陰性和假陽性；另外，檢測成本較高，外送檢測周轉(zhuǎn)時間(turn-around time,TAT)較長。且mNGS作為一種新型檢測方法，陽性結(jié)果僅代表臨床標(biāo)本中檢出某病原體的核酸片段，無法確定該病原體與感染之間的關(guān)系，在有條件的情況下，還應(yīng)用其他方法或者感染相關(guān)的標(biāo)志物進(jìn)行驗證。因此，mNGS尚不宜作為常規(guī)檢測技術(shù)，需要掌握適應(yīng)癥。隨著測序技術(shù)的發(fā)展以及越來越多的醫(yī)院臨床實驗室自主開展mNGS檢測，建立規(guī)范化檢測流程和結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)已成為業(yè)內(nèi)專家的共識。預(yù)計在未來5～10年內(nèi)，mNGS操作將更加自動化，流程更加標(biāo)準(zhǔn)化，成本亦將顯著降低，有望成為感染性疾病病原學(xué)診斷的常規(guī)檢測技術(shù)。

致謝：感謝陳昊(杭州杰毅生物技術(shù)有限公司)和麻錦敏(深圳華大因源醫(yī)藥科技有限公司)對本文的建議和指導(dǎo)。