解毒通絡調肝方對INS-1細胞糖毒性的保護作用研究

張琦 靳雯棋 張乃文 安珊 徐慧琛 樸春麗

目前，中國糖尿病的發病率飛速增長，根據最新全國流行病學調查報告，其形勢不容樂觀，成年人患病人數約為1.298億[1]。因此防治糖尿病刻不容緩。糖尿病及其并發癥的發生皆與β細胞數量減少及功能損傷直接相關[2]，長時間暴露在高糖之下會誘發β細胞凋亡[3]。目前越來越多的研究表明，內質網應激與胰島β細胞的功能和數量密切相關[4]。胰島β細胞具有高度發達的內質網，而內質網膜上有3種跨膜蛋白，即：阻抗性激酶lα(inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)、雙鏈RNA依賴性蛋白激酶樣內質網激酶(protein kinase R -like endoplasmic reticulum kinase，PERK)和活化的轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)[5]，這3種跨膜蛋白是能引起未折疊蛋白反應的效應蛋白[6]。當機體處于高糖環境時，內質網未折疊或錯誤折疊蛋白增多，導致其功能紊亂，即而發生未折疊蛋白反應。當未折疊蛋白質在內質網中積累時，IRE1α、ATF6、PERK 3條信號通路就會被激活，從而介導胰島細胞的損傷[7]。因此，在治療2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)時，從調控內質網應激方面入手將會成為一個新的治療方向。

糖尿病屬于中醫“消渴”范疇，其發生發展與肝臟關系密切，“從肝論治”已成為中醫治療糖尿病的重要理論依據之一[8]。解毒通絡調肝方是基于“毒損肝絡”理論確立治療T2DM的有效方劑，在前期的大量臨床試驗中驗證[9-10]，解毒通絡調肝方對T2DM及其并發癥的患者治療效果明顯，具有促進糖脂代謝、緩解臨床癥狀的作用。前期基礎實驗研究證明解毒通絡調肝方可改善糖脂代謝及胰島素抵抗，抑制其胰腺組織細胞凋亡[11-12]。本研究采用體外培養的大鼠胰島β細胞株[大鼠胰島細胞瘤細胞(islet cell tumor cell,INS-1)]，觀察解毒通絡調肝方對高糖誘導的INS-1細胞損傷和對胰島β細胞保護的影響，并從內質網應激角度探究其可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與藥物

INS-1細胞購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。將細胞株培養于含10%的1640 培養基中，在37℃，95%濕度，5%CO2培養箱中培養。采用對數生長期細胞進行后續實驗。

解毒通絡調肝方，藥物組成：黃連 15 g、榛花10 g、酒大黃 6 g、黃芪15 g、丹參15 g、柴胡10 g，粉碎后加水3次，每次煮沸1小時，調節pH值為7，過濾2次，濃縮至2 g/mL，微孔膜過濾。在精制藥液中加入10%甘露醇，并將溶液的pH值調節至6～7，在-50℃下預凍4小時，在-20℃下升華14小時，在30℃下干燥10小時，獲得的凍干樣品。之后將藥物凍干粉溶于1640培養基中，按照中藥凍干粉終濃度分為低劑量組50 μg/mL、中劑量組100 μg/mL、高劑量組200 μg/mL，由廣州中醫藥大學深圳醫院(福田)制劑室提供，4℃保存。

1.2 主要試劑

1640 培養基及胎牛血清，Gibco 公司；大鼠胰島素Elisa試劑盒購，羅氏生物科技有限公司；噻唑藍(MTT)，Sigma公司；反轉錄試劑盒及RT-PCR 試劑盒，天根生物公司；引物，上海生物工程技術服務公司；GAPDH、IRE1α、ATF6、PERK抗體以及羊抗兔、羊抗鼠，美國CST中國公司。

1.3 主要儀器與設備

二氧化碳細胞培養箱，美國Thermo公司；超凈工作臺，山東博科生物產業有限公司；離心機，德國Eppendorf公司；倒置顯微鏡，日本尼康公司；電泳儀、PCR儀、轉膜儀，美國Bio-Rad公司；Infinite 200 PRO 酶標儀，瑞士Tecan公司；化學發光儀，GENE公司。

1.4 分析解毒通絡調肝方中化合物的理化性質

藥物的化學和分子性質主要由分子量(molecular weight，MW)、口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、藥物相似性(drug similarity，DL)、氫鍵供體原子數(number of hydrogen bond donor atoms，Hdon)、氫鍵受體原子數(number of hydrogen bond acceptor atoms，Hacc)和辛醇-水分配系數(octanol-water partition coefficient，LogP)決定[5]。因此從TCMSP數據庫中提取其參數，并分析各成分的性質。

1.5 細胞培養與分組

將INS-1細胞培養于含10%胎牛血清的1640培養液中，置于37℃、5% CO2飽和濕度培養箱中，待細胞生長至近融合時，通過胰蛋白酶消化細胞，1∶3傳代，并用于后續實驗。關于細胞分組，取對數期生長的INS-1細胞，用胰酶消化后，制備單細胞懸液，將其接種于新的培養板，24小時后棄培養液，細胞分為對照組、高糖誘導的模型組、解毒通絡調肝方不同濃度治療組(50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)，每組設置3個復孔。孵育24小時后收集，檢測各項指標待用。

1.6 MTT法檢測細胞的存活率

將對照組、解毒通絡調肝方組(50、100、200 μg/mL)的細胞，以1×104/孔接種于96孔培養板，培養24小時，棄去培養板中的上清，每孔加入100 μL濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液后，避光培養4小時，將MTT溶液棄去后，向每孔加入DMSO(150 μL/孔)，振蕩5分鐘后用酶聯免疫檢測儀測定490 nm處的吸光值，經過計算即可得到細胞存活率。

1.7 胰島細胞功能相關基因mRNA表達水平檢測

采用Trizol 試劑提取各組細胞中總RNA。然后用Infinite 200 PRO 酶標儀測量RNA的純度和完整性。使用PrimeScript RT試劑盒將2 μg總RNA逆轉錄成cDNA。RT-PCR采用SYBR Green PCR主混合物和Bio-Rad CFX96實時PCR檢測系統進行。熱循環條件包括40個循環：在95℃下變10秒，在60℃下退火10秒，在72℃下延15秒。對每個基因的PCR產物進行了相對定量分析，計算每個PCR產物條帶強度與GAPDH強度的相對比率。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 葡萄糖刺激胰島素分泌實驗

除對照組以外，其余各組細胞更換含20 mM的高糖培養基，PBS清洗，加500 μL無糖的 KRB Buffer 孵育1小時。棄掉上清，加500 μL含5 mmol/L(低糖)或20 mmol/L(高糖)葡萄糖的KRB Buffer，繼續孵育1小時之后，收集上清液，利用ELISA試劑盒檢測，按照說明書具體操作步驟繪制標準曲線，于酶標儀450 nm讀值，并將所得的吸光度值分別代入標準曲線的直線方程，計算各組細胞上清液中胰島素水平。

1.9 內質網應激相關蛋白表達水平檢測

用Western blot法分別檢測ATF6、PERK和IRE1α蛋白在各組細胞中的表達情況。收集分組培養后的細胞，用4℃預冷的裂解液裂解細胞10分鐘，用BCA蛋白定量試劑盒測試濃度，將其蛋白變性，而后SDA-PAGE電泳，電泳后蛋白質轉膜，膜轉至封閉液中1小時。一抗用封閉液1∶1000稀釋，后于4℃搖床孵育過夜。然后TBST漂洗5次，每次3分鐘，清洗后，二抗室溫孵育1小時，TBST再次漂洗5次，每次3分鐘。在膜表面均勻滴加化學發光液(A液∶B液為1∶1)，避光反應1～2分鐘。曝光顯影，采集圖像。通過軟件分析蛋白表達水平。

1.10統計學處理

2 結果

2.1 解毒通絡調肝方組分分析

從TCMSP數據庫中總結并可視化了解毒通絡調肝方中潛在成分MW、LogP、Hdon、Hacc、OB和DL的性質。值得注意的是，解毒通絡調肝方中每種草藥的潛在化合物的物理和化學性質是一致的。如圖1所示，潛在成分的分子量集中在100～1000之間，這些活性成分的LogP范圍為-3～11。對于DL和OB，課題組發現DL和OB分別集中在0.1～0.9和10～90之間。Hacc和Hdon均小于13。總的來說，解毒通絡調肝方的這些活性成分是具有小分子量和親水性的復雜化合物。

圖1 解毒通絡調肝方中每種草藥的化合物的理化性質

2.2 解毒通絡調肝方對INS-1細胞存活率的影響

采用MTT法檢測不同濃度的解毒通絡調肝方對INS-1細胞存活率的影響。如表2所示，與對照組相比，不同濃度的解毒通絡調肝方的細胞存活率不具有統計學差異(P>0.05)，說明不同濃度的解毒通絡調肝方(50、100、200 μg/mL)對INS-1細胞存活率無明顯影響。

表2 不同濃度的解毒通絡調肝方對INS-1細胞存活率的影響

2.3 解毒通絡調肝方對INS-1細胞的胰島素分泌功能的影響

利用GSIS方法對INS-1細胞的胰島素分泌量進行檢測。結果顯示，在高糖刺激下，模型組的胰島素分泌水平較對照組下降了50%左右，且具有顯著性差異(P<0.01)。用解毒通絡調肝方處理后，INS-1細胞的胰島素分泌增加，與模型組相比分別增加了24.7%、35.17%、49.1%。實驗結果表明不同濃度的解毒通絡調肝方均能增加INS-1細胞的胰島素分泌量, 且隨著解毒通絡調肝方濃度的增大，呈現出一定的劑量依賴性。見表3。

表3 解毒通絡調肝方對INS-1細胞胰島素分泌功能的影響

2.4 解毒通絡調肝方對INS-1細胞中INS1、INS2、PDX1、MafA mRNA表達的影響

通過檢測胰島素合成相關基因的表達發現，模型組INS-1細胞中INS1、INS2、PDX1、MafA 的mRNA 與空白組相比，表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.01)；不同濃度的解毒通絡調肝方顯著抑制INS1、INS2、PDX1、MafA的mRNA的降低，差異有統計學意義(P<0.01)，而且隨著解毒通絡調肝方濃度的增加，其作用效果愈加明顯。說明解毒通絡調肝方是通過提高胰島素合成相關基因的表達，來增加胰島素的分泌。見表4。

表4 解毒通絡調肝方對INS-1細胞中INS1、INS2、PDX1、MafA mRNA表達的影響

2.5 解毒通絡調肝方對INS-1細胞PERK、ATF6、IRE1α蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組細胞中IRE1α、PERK以及ATF-6的蛋白水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)，提示在高糖誘導下，內質網應激信號通路被異常激活。與模型組相比，不同濃度的解毒通絡調肝方組中的IRE1α、ATF6以及PERK的蛋白水平表達呈劑量依賴性下降，差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)，表明解毒通絡調肝方能抑制INS-1細胞中內質網應激相關蛋白的表達，緩解內質網應激。見圖2、表5。

表5 解毒通絡調肝方對INS-1細胞PERK、ATF6、IRE1α蛋白表達的影響

注：A：空白組；B：模型組；C：中藥低劑量組；D：中藥中劑量組；E：中藥高劑量組。

3 討論

T2DM發病率呈逐年上升的趨勢，其發病可影響患者的生活質量[14]，其中高血糖是糖尿病的主要臨床表現之一。當長期血糖升高，即發生葡萄糖毒性，胰島素的合成增加，造成合成與折疊的不平衡，可誘發內質網應激[15]，胰島β細胞則會受到不可逆的損傷，啟動凋亡程序，造成β細胞絕對數量減少[16]。胰島β細胞是機體唯一可以合成并分泌胰島素的細胞，促進胰島素合成與分泌是增強胰島β細胞功能的主要作用方式。因此，抑制高糖誘導的胰島β細胞損傷和胰島素抵抗是防治T2DM的有效途徑之一。

《金匱要略·心典》曰：“毒，邪氣蘊結不解之謂。”糖尿病屬中醫“消渴”范疇，其發生同樣離不開“毒”[17]，消渴患者過食肥甘厚味，體內水谷精微物質過盛產生“糖毒”“脂毒”等。“毒”與“絡”關系密切，經絡是毒邪傳變之通道，藏身之府第。《靈樞·本臟》言：“肝脆則善病消癉易傷。”肝主疏泄，調暢氣機，調節全身氣血津液的輸布及經絡的調達，與糖尿病的發生也有著密切的關系[18]。“毒損肝絡”使氣血逆流，引發氣血津液的運化失常，導致水谷精微生成、輸布和排泄出現障礙，繼而發生消渴。該理論的生物學內涵不僅包含痰、濕、濁、瘀等“宏觀之毒”，其深層機制還更應側重于在組織細胞層面上對“微觀之毒”的研究。課題組認為“微觀之毒”可能與細胞器損傷及細胞功能結構紊亂導致的內質網應激、細胞損傷等密切相關，基于以上學說，提出的解毒通絡調肝法是治療“毒損肝絡”引起的消渴病的有效治療方法，并創制解毒通絡調肝方用于治療T2DM，全方共奏清熱祛濁，化瘀通絡，解毒調肝，暢達氣機，推陳出新之功，探索“毒邪”理論中“微觀之毒”清除的生物學內涵。現代藥理研究表明，方中多味藥具有降糖、降脂、減脂、抗炎的功效[19-20]。以上皆為運用解毒通絡調肝方從“毒損肝絡”角度來論治糖尿病提供了理論依據。

解毒通絡調肝方出自“毒損絡脈”理論，是臨床治療T2DM的有效方劑，但解毒通絡調肝方對胰島β細胞功能的保護作用機制尚未闡明。胰島受損會導致胰島細胞的功能紊亂，從而影響胰島素的正常分泌。PDX1促進胚胎期胰芽形成，MafA促進β細胞最終成熟，對胰島的發育有著重要的影響[21]。INS1、INS2 基因編碼前胰島素原，與體內胰島素的濃度密切相關[22]。本研究通過檢測與胰島細胞功能相關的關鍵基因(PDX1、MafA、INS1、INS2)的mRNA的表達水平和GSIS實驗，結果表明，高糖可以抑制胰島素的分泌，而解毒通絡調肝方能夠有效的提高胰島素的分泌量，進而能夠改善高糖誘導的β細胞功能。內質網應激則是細胞正常生理狀態及病理狀態下常會遭遇到的重要負性事件，已被廣泛認為是誘導細胞損傷的重要內源性信號途徑之一[23]。內質網應激一方面可減少細胞內轉錄因子表達、前胰島素生物合成加工的速度，降低胰島素的合成與分泌能力；另一方面可抑制β細胞增殖并促進其凋亡直接減少β細胞的數量，最終導致機體胰島素分泌不足[24]。本研究表明，高糖環境能夠激活內質網應激相關的蛋白質(IRE1α、ATF6、PERK)過度表達，引起INS-1細胞的凋亡和功能紊亂，而解毒通絡調肝方能夠使內質網應激相關的蛋白質的表達水平下調，并與模型組有統計學差異。說明解毒通絡調肝方能夠抑制內質網的過度激活，進而促進INS-1細胞的存活。

綜上，解毒通絡調肝方是通過調節肝之疏泄，疏通氣血經絡，排除“糖毒”，使臟腑功能平衡以治療T2DM，且其作用機制是提高胰島素合成相關基因的表達，促進INS-1細胞的胰島素分泌，降低內質網應激，以恢復細胞內穩態平衡，減少糖毒性對β細胞損傷。為深入了解內質網應激與糖脂代謝紊亂的機制關聯提供了新的線索，從而使該途徑成為T2DM的潛在治療靶標，為防治T2DM的有效途徑和策略提供理論基礎和實驗依據，至于內質網應激介導的具體相關信號通路有待后續進一步實驗驗證。