小鼠肝炎病毒感染對shh等基因改造小鼠生殖性能的影響及其相應凈化方案

關升起*

（蘇州大學實驗動物中心 江蘇·蘇州 215123）

小鼠肝炎病毒（Mousehepatitisvirus，MHV）屬于冠狀病毒科，冠狀病毒屬，為單股RNA病毒，是已知冠狀病毒中體積最大的一個。其病毒粒子呈球形，外有囊膜，外包膜突起呈放射狀排列。根據(jù)不同的感染嗜性，小鼠常可分為呼吸株和嗜腸株兩型，其中，嗜腸株極少擴散至其他組織，而呼吸株可在肝臟與神經(jīng)系統(tǒng)中復制。多數(shù)情況下，MHV呈隱性感染，但在應激因素刺激下，可引發(fā)嚴重肝炎及神經(jīng)癥狀，并發(fā)展成為急性致死性疾病[1]。

目前，國內外均鮮見關于MHV感染影響生殖系統(tǒng)功能的報道，但經(jīng)過連續(xù)8年對蘇州大學外來隔離檢疫及委托人工輔助生殖小鼠的情況進行分析，發(fā)現(xiàn)MHV感染顯著影響部分基因改造小鼠的生殖系統(tǒng)功能。由于MHV可通過胎盤將病毒從母體向胎鼠垂直傳播，本研究利用小鼠受精3.5天前胚胎外層完整的透明帶的屏障作用，對患病小鼠采用體外受精+胚胎移植的方法進行凈化。結果表明，凈化得到的小鼠，其生殖系統(tǒng)功能可恢復至與同背景野生型的平均水平。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

委托我中心進行隔離檢疫及凈化保種的基因修飾實驗小鼠；購自上海斯萊克實驗動物有限公司的ICR雄鼠、C57BL/6J供卵小鼠、ICR代孕雌鼠。

1.2 主要試劑

孕馬血清促性腺激素（PMSG）和絨毛膜促性腺激素（HCG）購自寧波三生；自配輸卵管液培養(yǎng)試劑（HTF）；Mouse hepatitis virus (MHV)Elisa kit試劑盒購自XpressBio公司。

1.3 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo）、體視顯微鏡（OLYMPUS）、倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS）、相位差顯微鏡（Leica）、生物顯微鏡溫控儀（南京凱爾）、冰箱（海爾）、精密電子天平（上海舜宇）。

1.4 方法

1.4.1 結扎雄鼠

ICR雄鼠按照0.6mL/20g體重的劑量腹腔注射1.2%三溴乙醇進行麻醉。待小鼠進入深度麻醉狀態(tài)，固定四肢，仰臥位腹部剃毛，在小鼠雙股近心端高點連線于腹中線兩側對稱剪開1cm切口；找到包裹睪丸的脂肪團，將脂肪團和睪丸一起拉出腹腔；依睪丸位置，找到輸精管，用紅外線加熱器加熱彎口鑷至發(fā)紅，燒灼切斷輸精管；將輸精管、睪丸還納腹腔；依次縫合小鼠的肌層和表皮。將縫合好的小鼠放在待蘇醒籠盒中，籠盒下以溫控儀37℃加熱，等待小鼠復蘇。小鼠完成結扎后，單獨飼養(yǎng)1個月后方可使用。

1.4.2 供卵鼠的激素處理

本實驗采用胚胎發(fā)育的二細胞期進行移植。鑒于二細胞胚胎移植的實驗周期為5天，本研究選擇在每周的第一天，即周一開始實驗。周一的17:00，選3-5周健康同背景野生型雌鼠，腹腔注射5IUPMSG；周三17:00，對已注射過PMSG的雌鼠，腹腔注射5IU HCG。

1.4.3 精卵體外受精

（1）周四8:00，取待凈化雄鼠，按照0.6mL/20g體重的劑量腹腔注射1.2%三溴乙醇麻醉；仰臥位腹部剃毛，在小鼠雙股近心端高點連線于腹中線兩側對稱剪開1cm切口；剪下附睪尾，放入裝有300 LHTF試劑的0.5mL EP管中。

（2）超凈臺內打開EP管，取出附睪尾；將附睪尾放置在高壓滅菌過的濾紙上，吸取附著的液體、血液和脂肪；左手以顯微鑷夾起附睪尾，右手以顯微鑷緊靠左手顯微鑷夾取附睪尾的位置夾緊，左右手交替重復操作使附睪尾緩緩繃緊；以耳用探針挑破繃緊的附睪尾外壁，使小鼠精子涌出并在附睪尾外壁形成白色突起；更換新的顯微鑷小心夾取突出附睪尾外壁的頂端精子，放入已經(jīng) CO2平衡過的HTF液滴，將裝有HTF液滴的平皿放入CO2培養(yǎng)箱中溫育，30min后取出，檢查精子質量。

（3）周四8:00，取注射過PMSG及HCG的供卵雌鼠安樂死；仰臥位，剪開小鼠腹腔，找到小鼠子宮，再沿著子宮找到兩側的卵巢和輸卵管；在保證輸卵管膨大部完整的情況下，剪下輸卵管，并置于滅菌濾紙上吸干附著于上的血液、脂肪和組織液。

（4）將輸卵管置于已經(jīng)過CO2平衡過的HTF液滴的礦物油保護層中，剝開膨大部，挑出帶有卵丘細胞的小鼠卵細胞團，放入HTF液滴中。

（5）使用移液器，從檢查過小鼠精子質量的液滴邊緣處，吸取6 L小鼠精子，加入小鼠卵細胞的HTF液滴中，然后，將載有液滴的平皿放入CO2培養(yǎng)箱中溫育6小時。

1.4.4 胚胎移植

小鼠精子與卵子混合溫育6小時后，取出載有HTF液滴的平皿，置于顯微鏡下，挑選排出第二極體或形成雄原核的受精卵，以口吸管移入新的HTF液滴，置于CO2培養(yǎng)箱中溫育至次日8:00。

次日8:00，即周五8:00，從CO2培養(yǎng)箱中取出裝有受精卵的HTF液滴，挑選并計數(shù)二細胞數(shù)量。麻醉準備好的與結扎雄鼠合籠的見栓假孕雌鼠，側臥位，暴露并固定卵巢和輸卵管，將發(fā)育至二細胞的受精卵，經(jīng)輸卵管傘部注入小鼠輸卵管的膨大部。逐層縫合，將小鼠放入置于37℃熱臺上的小鼠籠盒中，護理小鼠，直至小鼠蘇醒。

1.4.5 小鼠肝炎病毒的檢測及凈化評判標準

凈化得到的F1代小鼠發(fā)育至5周齡時，每胎隨機選取F1代小鼠1-2只與代孕雌鼠一同使用ELISA法檢測小鼠肝炎病毒。若檢測鼠體仍有肝炎病毒存在，則判定凈化結果為不合格，重新凈化；若鼠體無肝炎病毒，保留小鼠并擴繁，待F2代小鼠發(fā)育至5周齡時，隨機選取F2代小鼠再次檢測，若仍合格，則認為凈化成功。

2 結果

2.1 小鼠肝炎病毒感染整體呈現(xiàn)增長趨勢

對2012年至2019年送我中心隔離檢疫小鼠及此期間委托我中心進行生物凈化小鼠的鼠肝炎病毒患病情況進行分析，發(fā)現(xiàn)小鼠肝炎病毒病整體呈現(xiàn)上升趨勢，如圖1（由于疫情影響，2020年送我中心隔離檢疫小鼠與委托凈化小鼠的數(shù)量都大幅減少，故未將2020年的數(shù)據(jù)加入統(tǒng)計）。

圖1：2012至2019年蘇州大學實驗動物中心外源動物感染小鼠肝炎病毒與接收凈化情況

2.2 小鼠肝炎病毒感染導致小鼠精子質量的下降

通過對不同小鼠的精子進行比較，發(fā)現(xiàn)感染小鼠肝炎病毒的基因改造小鼠，其精子受精能力顯著下降，如圖2。其在體外受精6h時排出第二極體與形成雄原核（圖2B、2E）的數(shù)量明顯少于相同背景健康的 C57BL/6J野生型（WT）小鼠（圖2A，1號為第二極體排出階段，2號為雄原核形成階段），在體外受精24h時二細胞（圖2D、2F）占比也明顯少于相同背景健康的C57BL/6J野生型（WT）小鼠（圖2C）。

圖2：患病基因改造小鼠精子的精卵結合率情況

2.3 小鼠肝炎病毒感染導致小鼠繁殖周期延長

通過對凈化前后小鼠的繁殖周期進行對比，發(fā)現(xiàn)感染小鼠肝炎病毒的小鼠，其繁殖周期明顯延長；而凈化后的小鼠，其繁殖周期可恢復至同環(huán)境同背景的健康C57BL/6J野生型小鼠（WT）水平，如圖3。

圖3：小鼠凈化前后繁殖周期對比

2.4 小鼠肝炎病毒感染導致小鼠每胎產仔數(shù)減少

通過對凈化前后小鼠的每胎產仔數(shù)進行對比，發(fā)現(xiàn)感染小鼠肝炎病毒的小鼠，其每胎產仔數(shù)明顯減少；而凈化后的小鼠，其每胎產仔數(shù)可恢復至同背景的健康C57BL/6J野生型小鼠（WT）水平，如圖4。

圖4：小鼠凈化前后每胎產仔數(shù)對比

2.5 小鼠肝炎病毒感染導致小鼠的每胎離乳數(shù)減少

通過對凈化前后小鼠的每胎離乳數(shù)進行對比，發(fā)現(xiàn)感染小鼠肝炎病毒的小鼠，其每胎離乳數(shù)明顯降低；而凈化后的小鼠，其每胎離乳數(shù)可恢復至同背景的健康C57BL/6J野生型小鼠（WT）水平，如圖5。

圖5：小鼠凈化前后每胎離乳數(shù)對比

3 討論

根據(jù)以往的報道，小鼠肝炎病毒（MHV）可引起腦膜腦炎、脊髓炎、肝炎、視神經(jīng)炎，可引發(fā)視神經(jīng)軸突丟失和脫髓鞘[3,4]。目前，此病毒常分為呼吸株（respiratory MHV strain）和嗜腸株（enterotropicMHVstrain）。呼吸株 MHV，即，MHV-1、MHV-2、MHV-3、MHV-JHM(MHV-4)、MHVA59，和MHV-S毒株，最初在鼻呼吸和嗅覺上皮中復制，隨后可傳播至肺、肝、骨髓、腦、淋巴組織和生殖系統(tǒng)器官，并在其中復制。嗜腸株，即MHV-D、MHV-DVIM、MHVY，和MHV-RI毒株，主要感染腸道，偶爾可擴散到肝臟，淋巴組織和脾臟[5,6]。呼吸株和嗜腸株的小鼠肝炎病毒在多數(shù)情況下均呈隱性感染；少數(shù)情況下，MHV在應激因素刺激也可導致急性致死性疾病，在臨床上通常可分為急性肝炎型和神經(jīng)型。

目前，雖然有MHV可感染生殖細胞的報道，但有關小鼠肝炎病毒影響小鼠生殖繁育能力的報道尚鮮有見到。

本研究根據(jù)連續(xù)8年對 MHV單一感染小鼠進行比較，分析發(fā)現(xiàn)MHV很可能也會對某些基因改造小鼠的繁殖性能產生顯著影響。如：相比于同背景健康C57BL/6J野生型小鼠（WT）繁殖周期的66.09±18.39天，MHV感染后的基因改造小鼠的繁殖周期延長至110.78±23.97天。而相比于同背景健康C57BL/6J野生型小鼠（WT）平均每胎產仔5.45±1.29只，MHV感染后的基因改造小鼠的每胎產仔數(shù)僅為2.00±1.20只。

導致患病小鼠繁殖周期延長的原因，可能是此株MHV入侵神經(jīng)系統(tǒng)使雄鼠性欲降低（這種推測通過小鼠合籠后雌鼠的陰道栓和陰道涂片進行分析，但目前此部分的數(shù)據(jù)并不完整，無法進行分析）。而導致患病小鼠平均每胎產仔數(shù)下降的原因，很可能是由于此株MHV感染降低了雄性小鼠的精子質量。研究通過對比 WT小鼠與患病小鼠精子體外受精6小時有效受精卵占比和體外受精24小時二細胞占比，發(fā)現(xiàn)患病小鼠6小時有效受精卵占比和體外受精24小時二細胞占比，均明顯（平均百分比分別為 36.48±12.53%和 21.02±9.57%）低于 WT 小鼠的66.94±11.91%和59.08±7.32%。這說明，至少在精子的體外受精能力方面，患病雄性小鼠已經(jīng)出現(xiàn)了顯著的下降。

至于同背景健康C57BL/6J野生型小鼠（WT）平均每胎離乳小鼠4.73±1.49只，患病小鼠的平均每胎離乳數(shù)僅為1.09±1.57只（個體差異巨大導致標準差大于平均值）的情況，則很可能是MHV對哺乳期仔鼠的致死作用所導致的。

同時，研究也發(fā)現(xiàn)，以體外受精+胚胎移植的方式對患病小鼠進行凈化是有效的。根據(jù)比較凈化前后的基因改造小鼠的繁殖能力，發(fā)現(xiàn)凈化后的小鼠，其平均繁殖周期可由患病中的110.78±23.97天縮短至65.89±23.33天，平均每胎胎產仔數(shù)可由患病中的 2.00±1.20只提高至5.24±1.56只，平均離乳數(shù)可由患病中的1.09±1.57只提高至 5.08±1.41只。

綜上，雖然MHV對生殖系統(tǒng)的具體致病機理尚不清楚，但研究發(fā)現(xiàn)，其對小鼠精子受精率的阻礙作用是顯著的。這可能意味著MHV出現(xiàn)了新的病毒株，也可能意味著已發(fā)現(xiàn)的MHV毒株，在感染部分基因改造小鼠后，可使其產生顯著的生殖功能抑制。

下一步研究，將對致生殖能力下降的病毒株進行完整測序，以判斷其是否發(fā)生了變異，并加強MHV對更多不同實驗小鼠的研究。