銨態氮素促進甘薯塊根形成的解剖特征及其IbEXP1基因的表達

王翠娟 柴沙沙 史春余 朱 紅 譚中鵬 季 杰 任國博

1 山東省煙臺市農業科學研究院, 山東煙臺 265500; 2 湖北省農業科學院糧食作物研究所 / 湖北省甘薯工程技術研究中心 / 糧食作物種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室, 湖北武漢 430064; 3 山東農業大學農學院 / 作物生物學國家重點實驗室, 山東泰安271018; 4 山東農業大學植物保護學院, 山東泰安 271018; 5 魯西化工有限公司, 山東聊城 252000

適宜塊根庫器官的建成對于最終甘薯塊根的高產優質具有重要的意義[1]。已有研究表明, 甘薯生長前期是塊根分化建成的關鍵時期, 其莖葉封壟時形成的單株薯塊數目性狀的表現與最終塊根產量的形成密切相關[2-4], 而塊根的分化建成因品種特性、栽培環境的不同, 單株有效薯塊數目會有顯著的差異。在甘薯生長前期, 根系統的構建和組成中不定根向塊根的變態分化, 是一系列基因分子表達和生理生化代謝協同作用的結果[2]。因此, 探索甘薯塊根形成的調控措施, 研究塊根分化建成解剖特征、分子或生理生化差異機制, 對甘薯高產優質具有重要的實踐價值和理論意義。

現有研究表明, 氮素作為甘薯前期生長的主要營養因素, 對塊根的形成具有重要的調控作用[5-7]。氮素虧缺甘薯根系細而少[8], 氮素過量會抑制不定根形成層活動, 使中柱細胞過度木質化[9-11], 均不利于甘薯塊根的形成[12-13]。在甘薯對不同形態氮素吸收與利用的研究中發現, 銨態氮素的施用利于甘薯生長前期根系的生長, 促進單株有效薯塊數目和最終塊根產量的形成[14]。同時, 其他作物的研究表明, 銨態氮素會改變根系解剖結構發育[15], 促進根系側根分枝的形成[16], 加快根生長發育進程[17]。而目前關于銨態氮素對甘薯塊根形成的影響尚缺乏系統全面的研究。基于以上認識, 本研究利用單株結薯數差異顯著的 2個甘薯品種商薯19和濟徐23為材料, 設置60 kg hm–2低氮和180 kg hm–2高氮2個氮素水平, 酰胺態和銨態2種氮素形態, 進行甘薯封壟期、收獲期塊根產量及產量構成因素的調查驗證, 采用盆栽試驗輔助了解其塊根分化建成在顯微細胞水平的發生過程, 并對影響甘薯塊根分化發育的IbEXP1基因在關鍵發育時期的表達進行分析, 從解剖和分子水平深入認識銨態氮素處理促甘薯塊根形成的機制, 旨在為大田生產中通過適量銨態氮肥促塊根形成提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗于2014—2015年在山東農業大學農學實驗站(山東泰安)進行。供試品種為單株結薯數差異顯著的淀粉型甘薯品種商薯19 (S19)和濟徐23 (J23), 其中, 商薯19薯塊多而勻, 結薯數一般是5～6個, 而濟徐 23大中薯率較高, 結薯數一般是3～4個。供試土壤質地為沙壤土。2014年0～20 cm土層土壤含有機質 1.44%、堿解氮 67.65 mg kg–1、速效磷 16.00 mg kg–1和速效鉀77.80 mg kg–1; 2015年0～20 cm土層土壤有機質含量為1.69%、堿解氮含量為73.67 mg kg–1、速效磷含量為18.83 mg kg–1、速效鉀含量為76.56 mg kg–1。

本試驗包括大田試驗和盆栽輔助試驗兩部分。大田試驗采用三因素裂區設計, 品種為主區, 以甘薯品種 S19和 J23為供試材料; 氮素水平為裂區,設純氮 60 kg hm–2低氮(LN60)和 180 kg hm–2高氮(HN180) 2個水平; 氮素形態為裂裂區, 設銨態氮素硫酸銨(AN)和酰胺態氮素尿素(XN) 2個水平,以不施氮(N0)為對照。共 10個處理, 基施且均配以24 g m-2的鉀肥(K2O), 其中所有酰胺態氮素處理基施以相同氮素水平下銨態氮素處理同等水平的純硫(升華硫), 進行土壤施用硫素的平衡。

其中, 大田試驗分別于2014年5月15日栽植、10月22日收獲和2015年5月12日栽植、10月24日收獲。小區面積16 m2, 行距0.8 m, 株距0.25 m,栽植密度為5株 m–2, 基施鉀肥(K2O) 24 g m–2, 以甘薯品種作為處理水平, 4次重復, 隨機排列; 盆栽試驗于 2015年進行, 栽植時間與 2015年大田試驗一致, 選用高 0.25 m, 上下內徑分別是 0.23 m 和0.20 m的硬塑料盆, 取大田耕層土壤, 每盆裝土10 kg,栽植秧苗1株, 每個處理各栽20盆, 其余處理與大田試驗一致。

1.2 取樣方法

大田試驗中設置專門取樣區, 分別于莖葉封壟期(大約秧苗栽后45 d)和收獲期(大約秧苗栽后165 d)取樣。其中, 莖葉封壟期從每個處理選擇長勢一致的代表性植株5株, 將所有根徑≥0.5 cm的根系挖出, 計算單株形成的薯塊數和平均單薯鮮重, 并參照Tanaka等[18]和Noh等[19]的標準, 按照根徑范圍進行形成薯塊組成的分類, 其中介于 0.5～1.0 cm的幼根列為幼齡薯塊(young storage root, YSR), 根徑介于1.0～5.0 cm并形成局部膨大的塊根列為發育薯塊(developping storage root, DSR), 根徑大于5.0 cm的塊根列為成熟薯塊(mature storage root, MSR); 而收獲期將每個試驗小區根徑大于1 cm并形成局部膨大的薯塊納入計數和稱取鮮重的范圍, 調查小區的株數、有效薯塊數目和薯塊鮮重產量, 并計算單株有效薯塊數和平均單薯鮮重。

2015年盆栽試驗為研究甘薯塊根分化建成的輔助試驗。以甘薯塊根形成過程中內部形成層的活動為依據, 在幼根向塊根分化前的前形成層期、分化的初生形成層活動時期和建成的次生形成層活動時期這 3個主要變化的關鍵節點取樣, 大約為秧苗栽后7、14和21 d, 進行塊根分化過程的解剖學觀察;同時對塊根分化關鍵時間點(初生形成層活動期)和建成關鍵時間點(次生形成層活動初期)的取樣發育根進行IbEXP1基因表達的檢測試驗。其中, 在根系解剖學觀察試驗的根系取樣中, 須將整株根系挖出、沖根, 每株選取著生的最粗不定根3條(最具分化潛力的不定根), 距其著生端5～10 cm處截取最粗部位1 cm左右長度, 先于FAA固定液(其中的酒精濃度為50%)中進行殺死固定, 固定6～8 h之后, 60%乙醇過渡0.5 h, 最后浸泡于70%酒精, 4℃冰箱保存;而基因表達試驗的根取樣, 將最粗 3條不定根膨大部位及其以上部切段(切段長度≈1 cm), 然后切片并各自混勻, 液氮速凍, -80℃保存。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 根系解剖學觀察 采用石蠟切片法, 參照葉寶興等[20]方法, 并分別利用番紅-固綠、間苯三酚和高碘酸席夫試劑染色。番紅-固綠染色切片用以觀察初生形成層的發育和薄壁組織細胞的活動; 根據間苯三酚切片顏色反應的深淺, 觀察幼根內中柱細胞和導管的木質化程度; 高碘酸希夫染色切片, 觀察淀粉粒分布。用 OLYMPUS BX51型光學顯微鏡觀察根系結構并拍照, 采用IMAGE-Pro PLUS v 6.0圖片處理軟件和人工計數測量量化指標。

1.3.2 實時熒光定量(Real-time quantitative PCR)基因檢測 參照劉德高[21]方法, 采用異硫氰酸胍提取液結合10% (w/v) KOAc和1% (w/v) CTAB沉淀多糖的方法提取甘薯根組織總RNA[22], 用First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Germany)合成cDNA第1鏈。通過NCBI網(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)得到IbEXP1基因序列, 利用Primer Premier 5設計基因 3'和 5'端特異性引物(IbEXP1-F:5′-CGGAATTCATCAAACACCI-3′和IbEXP1-R:5′-TGTCTCCACACTCAGC-3′), 引物和相關基因的實時熒光定量檢測委托華大基因公司完成。

實時熒光定量 PCR檢測的熒光染料為 SYBR Green (廈門致善生物科技有限公司), PCR熱循環儀是Bio-Rad CFX 384, 所用操作軟件為Bio-Rad CFX Manager, 使用兩步法進行 PCR擴增, 程序設置為95℃ 10 min; 95℃ 15 s, 60℃ 1 min, 35～40 個循環。使用融解曲線分析檢測擴增產物的特異性, 反應程序為 95℃ 15 s, 60℃ 1 min, 95℃ 15 s, 60℃ 15 s。以甘薯肌動蛋白基因β-Actin作為內參基因(GenBank登錄號為AY905538), 對不同樣品的基因表達量進行均一化評估葉[22]。每個反應設3次重復,采用2?ΔΔCt分析法測定基因的相對表達水平。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2013軟件計算數據, SigmaPlot 10.0軟件制圖, SAS 9.2軟件分析數據, 三因素隨機區組法分析收獲期塊根產量的方差、三因素完全隨機法分析其他項目方差, 利用 Duncan’s新復極差法檢驗進行處理間的差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 收獲期塊根產量及產量性狀

2014年和 2015年大田收獲的塊根產量及產量性狀具有相似的處理效應, 因此將 2年的數據平均進行結果分析。由表 1可以看出, 在相同的處理條件下, 甘薯品種商薯 19 (S19)的單株有效薯塊數目和塊根產量均高于甘薯品種濟徐23 (J23), 其中對照處理(N0)條件下的增幅分別為62.83%和12.54%。同時, 2個甘薯品種均表現為低水平銨態氮素處理(AN60)的單株有效薯塊數目和塊根產量最高, 且差異顯著。高水平銨態氮素處理和酰胺態氮素處理不利于 2個甘薯品種單株有效薯塊數目的形成, 降低收獲期塊根產量。

由表2可以看出, 高低2個氮素水平和2種氮素形態對最終收獲的塊根產量和單株有效薯塊數目均有顯著影響, 且氮素水平和氮素形態 2種處理間的交互效應顯著。

表1 塊根產量及產量性狀(大田, 2014–2015)Table 1 Fresh yield of storage root and yield traits in field trials at harvest time (in the field, from 2014 to 2015)

表2 氮素形態和氮素用量對收獲期塊根產量與單株有效薯塊數目性狀影響的方差分析(F值, 2014–2015)Table 2 Partial correlated coefficients among yield traits in field trials at harvest time (F-value, 2014–2015)

2.2 莖葉封壟期的結薯特性

將2014年和2015年封壟期調查數據平均化進行結果分析發現, 氮素水平和氮素形態對 2個甘薯品種封壟期形成的薯塊數目均有顯著影響(表3)。在相同的處理條件下, 商薯19形成的單株薯塊數目高于濟徐23, 而其單株薯塊鮮重要低于濟徐23。其中對照(N0)處理條件下的結薯數較高的商薯19形成的單株薯塊數目顯著高于甘薯品種 J23, 其根徑介于0.5～1.0 cm的幼齡薯塊(YSR)和1.0～5.0 cm的發育薯塊(DSR)均高于甘薯品種J23, 而濟徐23形成了更多根徑大于5 cm的成熟薯塊(MSR)。同時, 相較于不施氮對照, 低水平銨態氮素處理(AN60)形成的薯塊數目最高, 其余氮素處理顯著降低或相似。其中商薯19氮素形態效應更加顯著, 銨態氮素處理形成的單株薯塊數目均高于酰胺態氮素, 2個甘薯品種的低水平氮素處理的單株薯塊數目均高于高水平氮素處理。其中, 在低水平銨態氮素處理(AN60)的單株薯塊組成中, 根徑介于0.5～1.0 cm和1.0～5.0 cm的薯塊數目均最高, 且差異顯著。說明該處理單株薯塊數目的優勢是因為其提高了根徑介于0.5～5.0 cm薯塊的形成。

表3 封壟期單株薯塊鮮重、單株薯塊數目及其組成(2014–2015)Table 3 Valid storage roots number, valid storage root fresh weight per plant and its compositional features during the canopy closure period in pot trials from 2014 to 2015

2.3 塊根形成過程幼根的解剖學觀察

2.3.1 前形成層期(秧苗栽后7 d)幼根內部結構

圖1和圖2為前形成層期2個甘薯品種各處理最粗3條幼根相同切片的番紅-固綠、間苯三酚和高碘酸席夫染色橫截面, 分別用以觀察初生形成層的發育和薄壁組織細胞的活動, 中柱細胞、導管的木質化程度, 淀粉粒分布等。此時期各處理幼根解剖結構與一般雙子葉植物幼根相似, 結合其部分量化指標(表4)可以看出, 低水平氮素處理不同程度的提高了2個甘薯品種幼根直徑、中柱直徑和中柱占根橫截面比例。其中, 低水平銨態氮素處理(AN60)幼根原生木質部束的導管數目及中柱薄壁組織木質化薄壁細胞數目顯著高于不施氮對照(N0)和其余氮素處理。

表4 秧苗栽后7 d幼根根內部結構部分量化指標(2015)Table 4 Quantitative indices of young root internal structure in different treatments on the seventh day after planting in 2015

2.3.2 初生形成層活動期(秧苗栽后 14 d)幼根內部結構 與前形成層期相比, 圖3和圖4中各處理幼根的初生形成層開始向外擴展, 原生木質部導管因形成層薄壁組織的活動開始分離, 與形成層分裂分化的薄壁細胞構成次生木質部。結合其內部初生結構的部分量化指標(表 5)發現, 低水平銨態氮素處理(AN60) 2個甘薯品種的幼根直徑、中柱直徑和中柱占根橫截面比例不同程度的高于不施氮對照(N0)和其余氮素處理。通過間苯三酚和番紅固綠2種不同染色切片對比觀察, 與不施氮對照(N0)相比較, 氮素處理不同程度的提高了 2個甘薯品種的次生木質部束數目和薄壁組織木質化的薄壁細胞數目, 且木質化薄壁細胞數目的氮素水平效應顯著, 高水平氮素處理顯著的高于低水平氮素處理。其中, 低水平銨態氮素處理(AN60)的次生木質部束最多, 而木質部間薄壁組織的木質化薄壁細胞數目介于不施氮對照(N0)和其余氮素處理間。說明該處理幼根的初生形成層活動力強,中柱薄壁細胞木質化適度。此外, 高碘酸希夫染色切片圖中該時期各處理均開始有少量淀粉粒產生于初生形成層外側的薄壁細胞中, 但未見處理間差異。

表5 秧苗栽植后14 d幼根根內部結構部分量化指標Table 5 Quantitative indices of young root internal structure in different treatments on the 14th day after planting

2.3.3 次生形成層活動初期(秧苗栽后 21 d)分化根的內部結構 圖5和圖6為秧苗栽后21 d時2個甘薯品種各處理最粗根膨大部位的 3種染色切片的橫截面圖, 相較于初生形成層活動時期, 各處理幼根進一步發育, 初生形成層分裂的薄壁細胞數目越來越多, 中柱擴大。同時, 其中的原生木質部、后生木質部和次生木質部, 因薄壁組織細胞的活動而星散在中柱的薄壁組織間, 與以木質部的導管群或單個導管為中心的周圍薄壁組織形成次生維管束, 開始次生形成層的活動。結合表 6發現, 在次生形成層活動初期(秧苗栽后 21 d), 低水平銨態氮素處理(AN60) 2個甘薯品種的幼根直徑、中柱直徑和中柱占根橫截面比例均高于其余處理, 差異顯著。在番紅固綠和間苯三酚2種染色切面結構的比較中發現, 與初生形成層活動時期的表現規律相似: 與不施氮對照處理(N0)相比較, 各氮素處理不同程度的提高了2個甘薯品種的次生維管束數目和木質化薄壁細胞數目, 其中低水平銨態氮素處理(AN60)的次生維管束數目顯著高于其余處理, 且在中柱的分布也更為分散。說明該處理在初生形成層活動期形成較多的次生木質部及其周圍的薄壁組織, 利于此時期次生形成層維管束的形成和次生形成層的發生活動, 促進塊根建成。此外, 淀粉粒在初生形成層外側的皮層薄壁細胞中大量積累貯藏, 但高碘酸希夫染色切片圖未見各處理間差異。

2.4 塊根分化建成中IbEXP1基因的表達分析

由圖7可知, 2個甘薯品種IbEXP1基因在塊根形成過程的表達具有較為相似的變化規律。在初生形成層活動期(秧苗栽后14 d), 商薯19各氮素處理相對于不施氮對照(N0)根系IbEXP1基因的表達上調, 其中低水平銨態氮素處理(AN60)的IbEXP1基因上調表達幅度最高, 高達75; 而濟徐23低水平銨態氮素處理(AN60)的IbEXP1基因顯著上調。次生形成層活動初期(秧苗栽后 21 d), 相較于不施氮對照, 氮素處理不同程度的提高了 2個品種甘薯幼根中IbEXP1基因的表達, 氮素水平處理效應顯著, 高水平氮素處理IbEXP1基因的表達要高于低水平氮素處理; 同時不同形態氮素處理間也有差異, 酰胺態氮素處理IbEXP1基因的表達要高于銨態氮素處理。其中, 低水平銨態氮素處理(AN60)IbEXP1基因的表達高于不施氮對照處理(N0), 但低于其余氮素處理。

3 討論

3.1 封壟期結薯特性及收獲期塊根產量

一般在甘薯莖葉封壟期, 單株有效薯塊數就基本穩定[11,23], 且此時單株有效薯塊數目性狀的表現對于最終塊根產量的形成具有重要意義[2-4,24]。本研究試驗2014年和2015年莖葉封壟期對照(N0)處理條件下, 2個甘薯品種結薯特性單株有效薯塊的組成中, 商薯 19側重于有效塊根的分化(形成更多根徑介于0.5～1.0 cm和 1.0～5.0 cm的薯塊), 而濟徐23側重于塊根的膨大發育(形成了更多根徑大于 5 cm的薯塊), 且收獲期單株有效結薯數較高的商薯 19的塊根產量顯著的高于濟徐 23, 說明在生長前期甘薯塊根的分化建成相對于塊根的膨大生長對最終塊根產量的形成具有更為重要的意義。同時, 在 2014年和 2015年莖葉封壟期不同氮素處理結薯特性的比較中發現, 與其余處理相比較, 60 kg hm–2銨態氮素處理2個品種甘薯植株均提高根徑介于0.5～1.0 cm和1.0～5.0 cm的薯塊數目, 因此顯著地提高其單株有效薯塊數目, 并最終實現了 2年收獲期顯著最高的塊根產量。說明60 kg hm–2銨態氮素處理通過促進生長前期單株有效薯塊的分化建成, 實現了最終塊根產量的提高。

3.2 銨態氮素促進甘薯塊根形成的解剖特征及與IbEXP1基因表達的關系

甘薯塊根的分化建成主要由不定根初生形成層和次生形成層的活動共同決定著: 不定根初生形成層活動能力強、中柱薄壁細胞木質化程度低, 利于不定根幼根向塊根的分化發育[8,11]; 次生形成層活動能力強, 活動范圍廣, 促進塊根形態的建成[9-10,23-25]。近些年研究發現, 對植物細胞生長分化有顯著調控作用的擴展蛋白基因IbEXP1, 可以作用于甘薯幼根形成層細胞的分裂活動和中柱組織細胞的木質化以調控甘薯塊根的分化建成[26-29], 與塊根形成密切相關。本試驗對幼根向塊根分化建成的 3個主要變化的關鍵時間節點進行取樣, 觀察不同處理幼根在顯微細胞水平的生長發育特點。在本研究試驗對照(N0)處理條件下, 2個結薯特性不同甘薯品種的幼根在向塊根分化建成中, 單株有效結薯數較高的商薯19的優勢根(取樣時期最粗壯的幼根)發育根徑和中柱直徑均小于濟徐 23根徑, 其中商薯 19各取樣時間點根顯微結構中的原生木質部數目、原生木質部導管數目、次生木質部束數目和次生維管束數目均不同程度的少于濟徐 23。說明同發育時期濟徐 23比商薯19更加的側重于幼根的膨大生長。同時在不同氮素處理的比較中, 60 kg hm–2銨態氮素處理2個品種甘薯的幼根在向塊根分化建成中的幼根直徑、中柱直徑和維管組織結構(原生木質部束導管、次生木質部束和次生維管束)均具有顯著的發育優勢。說明該處理幼根的初生生長和早期次生生長活動能力強,分裂分化了更多的薄壁細胞和維管組織, 既擴大了根徑, 同時為幼根后續生長發育提供營養貯藏的空間和更多水養吸收、輸送的可能性, 促進塊根形成。

表6 秧苗栽植后21 d分化根根內部結構部分量化指標(2015)Table 6 Quantitative indices of young root internal structure in different treatments on the 21th day after planting in 2015

同時, 我們發現在塊根分化和建成這 2個關鍵時間節點IbEXP1基因的表達分析中, 各處理幼根IbEXP1基因的表達與幼根薄壁組織細胞的木質化程度、木質部導管數目具有相同的變化規律。與不施氮處理相比較, 氮素處理可以提高甘薯幼根IbEXP1基因的表達, 并顯著提高甘薯幼根薄壁組織細胞的木質化程度和木質部導管數目。其中, 60 kg hm–2銨態氮素處理 2個品種甘薯幼根在塊根分化的初生形成層活動時期(秧苗栽后14 d)IbEXP1基因高水平表達, 其次生木質部束最多; 而在塊根建成的次生形成層活動初期(秧苗栽后 21 d), 與其余氮素處理相比較,IbEXP1基因的表達相對下調, 其IbEXP1基因的相對表達量和中柱木質化薄壁細胞數目均介于不施氮對照(N0)和其余氮素處理之間。結合前人在實驗室離體培養IbEXP1基因反義植株幼根的中央木質部木質化程度低[30-32]的研究結果,我們推測認為, 本研究塊根分化建成中, 氮素處理促進幼根IbEXP1基因的相對表達, 不僅提高中柱組織細胞的木質化程度, 也作用于中柱維管組織的木質部導管的形成。但本試驗條件下幼根IbEXP1基因表達和形成層細胞活動規律, 與 Noh等[30-31]的研究結果不盡相同, 分析考慮歸因于本試驗大田開放環境和前人實驗室離體培養2種不同培養條件下幼根生長發育進程的差異性。其中, 前人測定IbEXP1基因表達, 取樣于實驗室離體培養10 d和21 d時的反義植株幼根, 根徑均小于 10 mm, 且未發生局部膨大變化[31], 而本試驗大田盆栽秧苗栽后14 d和21 d的取樣幼根開始加粗,IbEXP1基因表達的測定取樣于幼根的局部膨大部位(根徑大于10 mm)。我們認為本試驗條件下對幼根IbEXP1基因表達與塊根分化建成關系的討論具有更好的參考性。

4 結論

在本試驗條件下, 單株有效結薯數較高的商薯19的塊根產量顯著的高于濟徐23, 在生長前期甘薯塊根的分化建成相較于塊根的膨大生長更利于最終塊根產量的形成。其中, 60 kg hm–2銨態氮素處理2個品種甘薯幼根建立了更利于不定根幼根向塊根形成的根組織結構分化發育基礎。前形成層時期原生木質部束的導管數目及中柱薄壁組織木質化薄壁細胞數目最多; 初生形成層發育時期IbEXP1基因高水平表達, 幼根直徑、中柱直徑大, 原生、次生木質部束數目多; 次生形成層活動初期IbEXP1基因的相對表達和中柱薄壁細胞的木質化程度介于不施氮和高氮素處理之間, 但幼根直徑、中柱直徑和中柱占橫截面比均顯著最高, 在塊根分化建成中建立了薄壁組織細胞木質化活動和分裂活動的平衡。該處理在莖葉封壟期形成更多根徑介于0.5～5.0 cm的低齡薯塊, 以此顯著提高單株有效薯塊數目, 且2014—2015年收獲期塊根產量最高。