河南大豆新品系抗大豆疫霉根腐病基因鑒定

張雪翠 孫素麗 盧為國 李海朝 賈巖巖 段燦星 朱振東,*

1 中國農業科學院作物科學研究所, 北京 100081; 2 河南省農業科學院經濟作物研究所, 河南鄭州 450002

大豆[Glycine max(L.) Merrill]含有豐富的蛋白質、油脂和人體所需要的多種微量元素, 是世界上重要的糧食作物和經濟作物。我國是大豆主要生產國, 目前生產規模居世界第5位[1]。在生產中, 病害是制約大豆產量的重要因素, 其中由大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆疫霉根腐病是破壞性的大豆病害之一, 廣泛發生于世界各主要大豆產區, 嚴重影響大豆的產量和品質[2]。在中國, 大豆疫霉根腐病首先于1989年在東北被發現[3], 隨后該病害的發病區域不斷擴大, 成為影響我國大豆生產的主要病害[4-5]。

大豆疫霉是一種土傳性病原菌, 通過土壤、水流等進行傳播和蔓延, 其卵孢子可以在土壤中存活數年, 在高濕度條件下卵孢子萌發形成孢子囊,遇水釋放游動孢子侵染植株。大豆疫霉在大豆的整個生育時期都能侵染, 導致出苗前和出苗后死亡、苗期猝倒或成株期根莖腐。目前, 培育和種植抗病品種是控制大豆疫霉根腐病最為有效、經濟和環境友好的方法[2,6]。大豆對大豆疫霉的抗性包括由單個顯性基因控制的質量抗性和由多個微效基因控制的數量抗性, 其中質量抗性為研究的重點[7]。目前, 國內外已在大豆 2號、3號、7號、10號、13號、14號、16～19號染色體上鑒定了30多個抗疫霉根腐病基因[2,8-10]。大豆與大豆疫霉的互作符合基因對基因的關系, 在抗病品種選擇壓力下, 大豆疫霉容易產生新的毒力型, 從而導致抗病品種的抗性喪失[11-13]。因此, 需要不斷培育和利用新的抗病品種。

河南省近年來大豆種植面積約 57.33萬公頃,位居全國第 4位[14], 在悠久的大豆栽培過程中,通過與病原菌的相互作用及人為選擇, 河南大豆蘊藏了豐富的抗病性資源。國內外研究表明, 河南大豆品種及資源普遍存在對大豆疫霉根腐病的抗性[15-16], 其中許多品種具有廣譜的抗病性。目前,部分河南大豆品種所含的優異抗疫霉根腐病基因已被鑒定[17-19]。大豆品種鄭97196是國內篩選到的大豆疫霉根腐病優異抗源之一[17,20]。張海鵬等[19]將鄭97196抗大豆疫霉根腐病基因初步定位在大豆3號染色體上, 定名為RpsZheng。最近, 我們對鄭97196抗疫霉根腐病基因RpsZheng進行了精細定位, 并開發了一個能夠有效檢測該基因的共分離InDel標記 WZInDel11[21]。

雖然河南省尚未有大豆疫霉根腐病嚴重發生的報道, 但有研究證明該地區存在大豆疫霉及致病型多樣性, 并且與其臨近的山東省、安徽省均有大豆疫病發生的報道, 表明具有大豆疫霉根腐病發生的潛在威脅[4,22]。目前, 河南省有目的抗疫霉根腐病的大豆育種尚未開展, 新育成的品系對大豆疫霉根腐病的抗性及基因型不明確, 因此, 在生產上推廣利用存在大豆疫霉病發生的風險。本研究對64個河南省新育成的大豆品系進行大豆抗疫霉根腐病鑒定,并利用RpsZheng的共分離標記進行抗病基因檢測,旨在為這些品系的推廣利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

64個河南大豆新品系、感病對照品種Williams和抗病品種鄭 97196分別由河南省農業科學院經濟作物所和中國農業科學院作物科學研究所提供(表 1)。

1.2 大豆疫霉

大豆疫霉分離物 Ps41-1由本實驗室分離保存,PsJS2由南京農業大學王源超教授提供(表1)。Ps41-1為我國東北地區大豆優勢毒力分離物(毒力型: 1a,1b, 1d, 2, 3a, 3b, 3c, 4, 5, 6, 7, 8), PsJS2為強毒力分離物(毒力型:1a, 1b, 1c, 1d, 1k, 2, 3a, 3b, 3c, 4, 5, 6, 7,8), 所有的大豆疫霉分離物使用時均在 V8汁瓊脂培養基上活化[23], 在24℃培養8～10 d, 用于接種。

1.3 抗病性鑒定

分別選取抗病對照鄭97196、感病對照Williams以及 64個河南大豆新品系 15粒種子, 播種在以蛭石為基質的1000 mL的紙杯中, 播種后在25℃溫室培養; 每個品系播種 2杯, 分別用于接種大豆疫霉分離物Ps41-1和PsJS2。待植株第1對真葉展開后,采用下胚軸創傷接種法進行抗性鑒定[18], 接種時,先用注射器針頭在大豆植株子葉下方1 cm處下胚軸劃一道長約1 cm的傷口, 再用注射器在傷口處注射約 0.2 mL的接種體。接種后的植株置于溫度為23～25℃、濕度為100%的保濕間內保濕48 h, 然后轉入25℃溫室內繼續培養3 d后進行表型調查[24-25]。抗性評價參照鐘超等[26]的標準, 每個品種的死亡率小于或等于 30%, 記為抗病(resistant, R); 植株死亡率在30%～70%之間, 記為中間類型(intermediate, I);植株死亡率大于或等于 70%, 記為感病(susceptible,S)。試驗重復2次。

1.4 大豆基因組DNA的提取

分別等量采集每個大豆品系 10株健康幼嫩葉片, 混合于2 mL試管中用于大豆基因組DNA的提取。采用新型植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱)(天根生物科技有限公司, 中國北京)提取大豆基因組DNA, 具體步驟參照試劑盒的使用說明。

1.5 標記鑒定

用鄭97196大豆抗疫霉根腐病基因RpsZheng的共分離標記 WZInDel11進行大豆品系分子標記檢測[21]。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成InDel標記。PCR反應體系為10 μL, 包含上下游引物各 0.2 μL、2 ×TaqPCR MasterMix (天根生物科技有限公司) 4 μL、模板 DNA 2 μL (20 ng), dd H2O 補足至10 μL。反應程序為94℃預變性5 min; 94℃變性45 s, 55℃退火45 s, 72℃延伸45 s, 35個循環; 72℃延伸10 min, 4℃保溫。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產物檢測[21]。

2 結果與分析

2.1 抗病性鑒定

抗病性鑒定結果表明, 感病對照品種 Williams對 2個大豆疫霉分離物均表現為感病, 抗病對照品種鄭97196對2個大豆疫霉分離物均表現為抗病。圖1顯示了鑒定的64個大豆新品系對2個分離物的抗、感反應比例。表1列出了每個品系對2個大豆疫霉分離物的抗性反應型。64個新品系中, 對大豆疫霉分離物Ps41-1和PsJS2表現為抗病的分別有35個和 16個, 分別占 54.7%和 25.0%, 對 Ps41-1和PsJS2表現為中間反應的分別有16個和10個品系,分別占25%和15.6%; 對Ps41-1和PsJS2表現為感病的分別有 13個和 38個品系, 分別占 20.3%和59.4%。洛豆 16106、開豆 1106、鄭豆 1304、洛豆16095、周豆47、鄭豆1526、周豆43、周豆45、鄭1307、周豆 38、安豆 5919、安豆 6223、周豆 37、安豆1498、鄭1807、漯8826共16個品系同時抗2個大豆疫霉分離物 Ps41-1和 PsJS2, 占鑒定品系的25% (表 1)。

2.2 標記基因型鑒定

張雪翠等[21]開發了一個廣譜抗大豆疫霉根腐病基因RpsZheng的共分離標記WZInDel11, 本研究利用該標記對64個品系進行RpsZheng基因檢測(表1和 圖2)發現, 洛豆 16106、鄭豆1304、洛豆16095、周豆47、鄭豆1526、周豆43、周豆45、鄭1307、安豆5919、安豆6223、周豆37、鄭1807、周豆38、漯 8825、駐豆 37、泛豆 22、鄭 15234、漯豆 8816共18個大豆品系含有WZInDel11標記, 占檢測總數的28.1% (表1)。其中有5個對1個或2個分離物表現為抗感分離的中間型品系(鄭15234、漯8825、漯豆8816、駐豆37和泛豆22)出現了雜合基因型(表1和圖 2), 表明基因型與表型結果相一致, 也表現為抗感分離。

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本研究進一步利用標記WZInDel11對出現雜合基因型的漯豆8816的6個感病單株和4個抗病單株進行分子檢測表明, 6個感病單株均擴增出了WZInDel11的感病目標片段, 而 4個抗病單株有 2個單株擴增出了WZInDel11的抗病目標片段, 另外2個抗病單株擴增出了抗病和感病目標片段, 其基因型表現為抗、感分離的雜合基因型(圖3)。表明表型為抗病的單株基因型存在純合抗病及抗感分離雜合基因型。

3 討論

本研究對河南省近年來新培育的64個大豆品系進行對2個大豆疫霉分離物的抗性鑒定發現, 有51個品系對1個或2個大豆疫霉分離物表現為抗病或中間反應, 將中間反應型歸為抗病反應[18,26], 抗病品系占鑒定品系的 79.7%, 這表明河南省近期育成的大豆新品系繼續保持對大豆疫霉根腐病高水平的抗性[20]。

采用對大豆疫霉根腐病具有廣譜抗性基因RpsZheng的共分離標記WZInDel11對64個品系進行抗病基因的分子檢測發現, 周豆37、周豆38、周豆43、周豆45、周豆47、鄭豆1304、鄭1307、鄭豆 1526、鄭15234、鄭 1807、漯 8825、漯豆8816、洛豆 16095、洛豆 16106、安豆 5919、安豆 6223、駐豆 37、泛豆 22共 18個大豆品系中檢測到WZInDel11的抗病目標片段。WZInDel11為RpsZheng基因的共分離標記, 我們的前期研究表明,攜帶Rps1c、RpsYD25和RpsYD29基因的大豆品種也含有該標記[21], 因此 WZInDel11標記可以作為Rps1基因座部分等位基因或緊密連鎖基因的檢測標記[18](鐘超, 未發表數據), 通過抗性反應型和系譜分析推測出含有 WZInDel11標記的大豆品種(系)的抗疫霉根腐病基因。本研究發現, 所有含有WZInDel11標記的品系對2個大豆疫霉分離物均表現為抗病型, 表明一些品系含有相同的抗疫霉根腐病基因。漯8816和漯8825的父本均為鄭97196, 抗病基因應該來源于鄭97196, 表明2個品系所含基因為RpsZheng[21]。豫豆 29為洛豆 16106和鄭 15234的親本之一, 2個品系的抗性應該起源于豫豆29, 因此含有RpsYD29[18]。鄭豆1526、鄭豆1304和鄭1307的親本之一為鄭9805, 鄭9805由豫豆23和豫豆22雜交育成, 推測這 3個品系的抗病基因來源于豫豆23, 含有RpsZheng或其等位基因[21,28]; 周豆47的親本之一為皖宿2156, 而皖宿2156由中作975和豫豆23 (鄭交8739-47)雜交育成, 因此, 周豆47的抗病基因應該來源于豫豆23, 推測其含有RpsZheng或等位基因[21,29]。周豆37、周豆38、鄭1807、周豆43和周豆45親本之一為周豆23或菏豆20, 這2個品種與鄭97196、豫豆23和豫豆25具有共同祖先, 推測這些品系含有RpsZheng、RpsYD25、RpsYD29或新的等位基因[21,27,30], 安豆6223和安豆5919的一個親本為安豆5156, 安豆5156以周9521-3-4為母本、獲黃三選-3為父本雜交育成[31], 周 9521-3-4與鄭97196、豫豆 29具有相同的抗大豆疫霉譜和相同的Rps1基因座單倍型[32], 因此, 我們推測, 安豆 6223和安豆5919可能含有RpsZheng或RpsYD29。駐豆37、洛豆10695和泛豆22的親本與鄭97196、豫豆23、豫豆25、豫豆29的親緣關系不明確, 推測含有新RpsZheng等位基因。

大豆疫霉分離物 PsJS2為江蘇省分離到的強毒力分離物, 能夠克服除Rps9、RpsQ、RpsHC18、RpsX、RpsZheng以外的其他已知抗疫霉根腐病基因, 因此,對 PsJS2表現抗病的大豆品種(系)很可能含有新的基因。本研究抗性鑒定結果表明, 開豆 1106、鄭1659、漯豆 8826、宛黃 7號、鄭 1227、鄭 1205、安豆 1498對 2個大豆疫霉分離物 Ps41-1和 PsJS2都表現為抗病反應或中間反應型, 但分子檢測這些品系中不含有WZInDel11抗病目標片段, 表明這些品系可能含有新的廣譜抗疫霉根腐病基因。最近,張志民等[33]鑒定77份大豆品種(系)對8個大豆疫霉菌株的抗性反應發現, 安豆1498是唯一一個對8個分離物表現為抗病的品系, 推測其可能攜帶新的抗病基因或新的抗病基因組合。本研究也發現, 安豆1498是唯一一個對 2個大豆疫霉分離物 Ps41-1和PsJS2均表現為純合抗病反應(植株死亡率為 0)但不攜帶 WZInDel11抗病目標片段的品系, 同樣, 我們也推測, 安豆1498可能含有新的抗病基因或新的抗病基因組合。根據朱振東等[17]的研究結果, 本研究中開豆1106的父本豫豆19與鄭97196對10個具有不同毒力的大豆疫霉菌菌株具有相同的反應型, 而SSR分析表明, 豫豆19與本研究中安豆5156的父本周9521-3-4具有很近的遺傳關系[31], 周9521-3-4與鄭97196、豫豆29具有相同的抗大豆疫霉譜和相同的Rps1基因座單倍型[31-32], 表明開豆 1106可能含有RpsZheng座位的新等位基因。

大豆對大豆疫霉根腐病的抗性存在由顯性單基因控制的質量抗性和由多基因控制的數量抗性 2種類型。由于質量抗性表現為完全抗性、容易利用和檢測, 國外大豆抗疫霉根腐病育種主要利用質量抗性[34]。下胚軸創傷接種是鑒定大豆對大豆疫霉根腐病質量抗性的主要方法[24-25]。抗性純合的大豆品種理論上接種非親和大豆疫霉分離物后的死亡率為 0,但在實際中大豆品種特別是大豆資源, 可能存在混雜或抗性分離而導致部分植株死亡, 因此絕大多數研究中將植株死亡率小于或等于 30%的品種或資源劃分為抗病, 死亡率在 31%～69%的歸為中間類型。由于中間類型品種中存在大量的抗性植株, 因此, 對大豆疫霉特別是對其強毒力分離物表現為中間類型的優異大豆品種或資源同樣具有重要的利用價值。

河南省具有豐富的抗大豆疫霉根腐病資源, 大多數骨干親本都具有對大豆疫霉的廣譜抗性[20]。因此, 河南育成的大豆品種大多對大豆疫霉具有高水平的抗性, 然而由于大豆疫霉根腐病抗性不是大豆育種的目標性狀, 育成的大豆品種或多或少出現抗性分離。在本研究中, 分別有 16個和 10個品系分別對大豆疫霉分離物Ps41-1和PsJS2表現為中間反應類型, 其中鄭1801對2個分離物均表現為中間類型, 表明這些品系存在抗性分離。本研究發現對 1個或2個大豆疫霉分離物表現為中間反應型的5個的大豆品系, 分別為漯8825、駐豆37、泛豆22、鄭15234和漯豆 8816, 分子檢測結果表明其為雜合基因型, 進一步從分子水平證明了這 5個品系存在抗性分離(圖2)。抗性分離品系的單株分子標記檢測結果表明, 表型為抗病的植株基因型表現為純合抗病和抗感雜合的2種類型(圖3)。這些抗性分離的品系通過 1～2輪抗性植株的接種選擇, 便可選育成純合抗病品系, 或利用抗病基因連鎖的共顯性分子標記WZInDel11直接鑒定純合抗性植株, 從而快速選育成純合抗病品系推廣利用。

4 結論

通過對河南省新培育的 64個大豆品系進行抗大豆疫霉根腐病鑒定發現, 有 51個抗病品系, 占鑒定品系的 79.7%, 利用抗疫霉根腐病基因RpsZheng的共分離標記WZInDel11進行分子檢測,鑒定了18個含有RpsZheng或等位基因的大豆品系,研究結果可為近期培育的大豆新品系的推廣和利用提供參考。