山西省古交市大豆胞囊線蟲新小種X12分布調查

練 云 王金社 魏 荷 李金英 弓貴明 王樹峰 張晶鵬 李茂林 郭建秋 盧為國,*

1 河南省農業科學院經濟作物研究所 / 國家大豆改良中心鄭州分中心 / 農業農村部黃淮海油料作物重點實驗室 / 河南省油料作物遺傳改良重點實驗室, 河南鄭州 450002; 2 古交市種子服務站, 山西太原 030200; 3 洛陽農林科學院, 河南洛陽 471023

大豆胞囊線蟲(soybean cyst nematode, SCN)病是一種世界性大豆病害, 常年給全球大豆生產造成數十億美元的經濟損失[1-2]。在前期調查研究中, 我們發現了具有超強致病力的大豆胞囊線蟲新生理小種X12[3](生理小種, 以下簡稱小種), 該小種的出現給大豆生產造成巨大威脅。調查X12小種分布及周圍生理小種類型, 是有目的地采取策略控制該病害發展的先決條件。

在中國兩大大豆主產區——東北大豆產區和黃淮海大豆產區均有大豆胞囊線蟲分布。前期調查研究發現, 在黃淮海大豆產區, 約有 70%的地區分布有大豆胞囊線蟲, 4號生理小種主要集中分布在山西省; 據 2012—2015年調查結果發現, 山西省主要分布有 2號和 4號生理小種, 該小種在山西省的檢出頻率分別為38.5%和38.5%[4]。

對大豆胞囊線蟲生理小種分類目前常采用的方法有2種: Riggs和Schmitt[5]于1988年建立的將大豆胞囊線蟲劃分為16個小種模式, 以及Niblack等[6]在2002年建立的將大豆胞囊線蟲劃分為128個小種的“HG類型”模式, 其目的均是通過鑒別寄主區分致病力不同的線蟲群體。2種劃分方法各有其適宜的使用范疇, 而從抗病育種目標出發, 大豆抗病育種專家認為劃分過細很容易給育種帶來困惑, 同時,為了便于同前期調查結果進行對比, 在中國, 相關研究專家仍采用Riggs鑒別模式。因此, 本研究也主要采用 Riggs鑒別模式對采取的土樣進行生理小種鑒定。而隨著致病性超強的 X12小種出現, 以上 2種鑒別模式所采用的寄主已不能有效將新生理小種從目前小種中區分開, 因此在生理小種鑒定中, 我們增加了一個鑒別寄主——興縣灰皮支, 用于從 4號小種中區分X12小種。

國內外目前所用主要抗源對大豆胞囊線蟲新小種X12均表現感病或高感[3]。這些抗源包括Riggs鑒別模式中的4個鑒別寄主[5], HG鑒別模式中的7個鑒別寄主[6], 中國的優異抗源興縣灰皮支(ZDD2315)[7-8]和美國目前在用的重要抗源PI437654以及用這2個抗源培育的抗病品種中黃57[3], 抗LY1線蟲群體的PI567516C[9]。在抵御由SCN給大豆生產帶來嚴重經濟損失的策略中, 培育抗病品種最經濟、有效, 然而目前缺乏抗源, 暫時限制了抗X12小種的抗病品種培育。因此, 采取輪作、化學殺蟲劑等手段對該地區SCN進行防控尤為重要。

縱觀SCN在全球范圍大豆產區的危害趨勢, 越來越多調查數據表明, SCN致病力正在升級且SCN擴散范圍仍在增大。SCN 1號小種僅能夠侵染Riggs鑒別模式中的寄主 PI88788, 2號小種能夠侵染Peking、Pickett和PI88788共3個寄主, 已有研究表明, 在中國黃淮海大豆產區及美國密蘇里州大豆產區, 優勢生理小種均由 1號小種[10-11]演變為 2號小種[4,12], 說明在以上 2個大豆產區分布的生理小種,其致病性已經增強。2005年調查發現, 在美國伊利諾伊州, 83%大豆田感染了大豆胞囊線蟲病, 其中70%感染田塊的線蟲能夠寄生于PI88788, 導致在該州使用現有抗性品種作為防治 SCN手段的有效性顯著降低[13]。隨后, 在其他產區也逐漸發現線蟲群體克服PI88788抗性, 導致在PI88788上的胞囊指數(female index, FI)升高[14-15]。在中國, SCN已經擴散到新疆、廣西、貴州等以前未受SCN侵染的大豆種植區[16-17]; 而在美國, SCN幾乎遍及所有種植大豆產區[14]。

SCN是一種土傳病害, 一旦大豆種植區受到侵染, 極難根除。盡管目前國內尚未有官方數據統計每年SCN給中國大豆生產帶來的經濟損失, 但在前期調查過程中已經發現, 在受到嚴重感染大豆產區,有“火燒苗”現象, 比如此次調查的古交市。建議采取主動措施對SCN進行防治, 避免發展到大豆大面積絕產、損失不可挽回時, 再考慮防治或重視抗病品種培育或進行抗病品種的推廣應用。

據 2012—2015年調查研究結果[4]發現, 山西省是國內大豆胞囊線蟲感染最嚴重的地區, 因為致病力最強的4號小種主要分布在山西省, X12就是在此次調查研究過程中于山西省古交市邢家社鄉采集的。2012—2015年在古交市僅取此1份土樣, 難以反映 X12小種發現地點周圍生理小種分布情況; 其次, X12小種在該市其他田塊是否也有分布以及是否有擴散現象, 是本研究關注的另一問題。本研究擬在前期調查研究的基礎上, 以邢家社為中心, 在古交市大豆種植區域密集采取土樣, 調查 X12小種周圍生理小種分布規律, 明確優勢小種和 X12小種的分布, 以期為防治X12小種擴散提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

Riggs模式鑒別寄主[5](Lee、Peking、Pickett、PI88788和 PI90763)和興縣灰皮支由河南省農業科學院經濟作物研究所大豆課題組保存。

1.2 土樣采集

于2019年大豆生長期, 在山西省古交市調查大豆胞囊線蟲分布情況, 在有大豆胞囊線蟲感染地塊取土樣33份, 覆蓋7個鄉鎮, 共33個村莊, 面積810 km2。取土依據是在根系上能看到胞囊或地上部分植株出現明顯矮化和失綠, 采集病株周圍3～8 cm深的土層, 每份土樣20～30 kg。采集路線沿山內屯蘭川、原平川、大川和北梁4條主干道開展。采集的樣本用塑料袋封住后, 物流到河南省農業科學院, 保存在16℃病土儲存室, 直至需要檢測時取出。

1.3 生理小種鑒定

參考練云等[4]方法, 略有改動, 簡述之: (1)鑒定方式。所有采集的土樣, 直接在溫室利用Riggs模式鑒定。對于在Lee上胞囊數目少于100個胞囊/株的土樣, 種植混合的 Lee、Essex和鄭 1307擴繁 1～2代胞囊后再通過接種進行生理小種鑒定。(2)胞囊繁殖。將子葉出土期的感病幼苗移栽至病土中, 每杯1株, 溫室培養, 約25 d后, 采用淘洗-過篩法將胞囊從根系上分離, 用橡皮擦輕輕研磨, 破碎胞囊, 然后將釋放出來的卵用清水懸浮, 取 10 μL在顯微鏡下計數蟲卵密度, 備用于接種鑒定。(3)接種方法。將壤土在 150℃烘干 1.5 h, 分裝在塑料杯中, 移栽子葉出土期且生長一致的 4個鑒別寄主及 Lee、興縣灰皮支, 每杯1株, 5個重復, 待長出新根后, 每杯接含2500個卵的懸浮液。25 d左右、胞囊處于顯囊盛期時, 計數根部胞囊數目。

1.4 胞囊計數

將胞囊通過淘洗-過篩法從根系中分離, 利用熒光顯微鏡拍照, 結合本課題自主研發的 PDS軟件,通過計算機掃描自動計數大豆胞囊數目, 具體方法見專利2014SR060158[18]。

1.5 數據分析及小種分布圖繪制

Lee上平均胞囊數目大于100, 認定此次試驗數據有效, 否則擴繁該土樣中的胞囊, 進行接種鑒定,如果 Lee上平均胞囊數目仍然達不到要求, 舍棄該樣本, 根據Riggs模式判別生理小種類型。FI = (待鑒定植株根系上平均胞囊數目×100/Lee根系上平均胞囊數目)。檢出頻率 = (屬某一種生理小種的樣本數目/鑒定出生理小種類型的所有樣本數目)×100%

將各采樣點鑒定出的小種類型, 利用統計分析軟件R的Maptools包[19]繪制生理小種分布圖。

2 結果與分析

在采集的 33份病土中, 共有 26份鑒定出生理小種類型, 其中15份直接利用采集的病土鑒定出生理小種類型, 另18份經繁殖1～2代后, 通過接種進行鑒定, 其中11份鑒定出生理小種類型, 7份由于未繁殖出足夠用于鑒定的胞囊, 故舍棄。古交市生理小種分布見圖1。

圖中所有彩色符號及灰色空心圓圈反映了受SCN感染的地塊。15份樣本鑒定為2號小種, 檢出頻率是57.7%; 11份樣本鑒定為4號生理小種, 檢出頻率是42.3% (表1); 2號和4號小種交叉分布。在鑒定為 4號生理小種的樣本中, 有 2個樣本進一步鑒定為X12小種, 其中一份來自最初發現X12的采集地點——古交市邢家社, 在圖中用紅色實心三角形 1表示, 另一份樣本來自古交市河口鎮, 在圖中用紅色實心三角形2表示, 這2個被檢測為X12的樣本, 在空間上有一定距離, 而且中間交叉分布有2號和4號小種, 可以排除古交市河口鎮的X12小種由古交市邢家社樣本感染所致; 在鑒定為 4號生理小種的樣本中, 有 3份在興縣灰皮支上的胞囊數分別為20 (FI=7.6)、46 (FI=9.6)和16 (FI=6.4), 在黃淮海生理小種鑒定中, 在興縣灰皮支上生長的胞囊數目一般在0～6個 株-1, 而且0個 株-1的占多數。這3份土樣有可能會優先發展為X12小種。

表1 采集自古交市26份樣本的生理小種類型鑒定(2019-2020年)Table 1 Virulence phenotypes of twenty-six samples collected from Gujiao city in 2019 and 2020

(續表 1)

鑒定出生理小種類型的所有26份SCN群體, 均能夠侵染PI88788。PI88788的抗性基因是目前SCN抗性大豆品種的主要抗性來源, 說明 SCN群體在PI88788上的致病力已經增強, 這種現象在美國中北部和中國東北也有報道: 據2005年調查結果發現,在美國伊利諾伊州, 83%大豆田感染了大豆胞囊線蟲病, 其中 70%感染田塊的線蟲能夠寄生在PI88788的根系上, 導致在該州使用現有抗性品種作為防治SCN手段的有效性顯著降低[20]; 隨后, 在美國其他大豆產區如密蘇里州也逐漸發現有部分線蟲群體克服PI88788抗性, 導致在PI88788上寄生的SCN胞囊指數升高[11]; 在中國東北大豆產區, 利用單胞囊繁殖法, 從HG type 0的SCN群體種分離出HG type 1.2.3.5.6.7、HG type 2.5.7及HG type 1.3[21]。另外, 在本研究中, 所有這26份SCN群體均能夠侵染Peking和Pickett, 34.6%的SCN群體能夠侵染寄主 PI90763, 表明需要慎重連續多年在同一田塊使用抗性基因來自這些抗源的大豆品種, 建議注重同非寄主作物輪作并且重視使用來自其他抗源的抗性品種。

依據以上鑒定結果, 每種類型群體各選擇1個生理小種群體, 利用HG type做進一步鑒定表明, 古交市存在1.2.5.6.7 (2號小種)、1.2.3.5.6.7 (4號和潛在優先發展為 X12的小種)及 1.2.3.4.5.6.7 (X12小種), 見表 2。本研究結果也反映了現有的 HG tpye不能區分開4號小種和潛在優先發展為X12小種群體。依據現有SCN群體, 尤其是X12小種的出現, 需要形成新的大豆胞囊線蟲生理小種鑒定模式。

3 討論

3.1 大豆胞囊線蟲生理小種鑒別模式選擇

目前對大豆胞囊線蟲生理小種類型鑒別, 是利用不同鑒別寄主以區分致病力不同的線蟲群體, 常用的方法有 2個, 分別為 Riggs和 Schmitt[5]采用 4個鑒別寄主建立的16個小種模式(Race模式), Niblack等[6]采用 7個鑒別寄主建立的 128個小種模式(HG type模式)。后一種方法將小種劃分得更細。基于 2種劃分方法適宜的使用范疇, 本研究是從抗病育種目標出發, 同 2012—2015年調查時一樣, 仍認為小種不宜劃分過細, 據已有研究結果表明, 線蟲分布較為復雜, 劃分過細容易給抗病品種選育及采取防御措施帶來困惑。同時, 為了便于同國內已有研究結果進行對比分析, 本研究仍然選擇使用Riggs鑒別模式對大豆胞囊線蟲新小種 X12分布進行研究。為了進一步從4號小種中鑒定出X12小種,在鑒別模式中, 本研究增加了國內優異抗源興縣灰皮支。

表2 利用HG type模式鑒定采集自古交市不同生理小種類型的樣本(2019-2020年)Table 2 Samples of different physiological subtypes collected from GuJiao city with HG type in 2019 and 2020

3.2 大豆胞囊線蟲新小種 X12分布及最初發現地點周圍的生理小種分布概況

本研究是在前期調查研究的基礎上, 對大豆胞囊線蟲X12首次發現地點——古交市邢家社周圍生理小種分布做進一步調查研究。在調查中, 途經每一個村莊的大豆或其他豆科作物田塊, 均能在植物根系上看到胞囊, 表明古交市田間受大豆胞囊線蟲侵染嚴重, 這與2012—2015年調查顯示山西省感染SCN嚴重的結果相符。此次共采集病土33份, 其中26份鑒定出生理小種類型。由于X12是我們首次發現的具有超強致病力新小種, 因此, 為了進一步了解 X12小種的分布, 本次調查以邢家社為中心, 開展了更為密集的取樣, 研究結果比較系統地反映了X12首次發現地點周圍生理小種分布的概況, 每份土樣附有精確的經緯度記錄, 這為今后進行周期監控研究奠定了基礎。從本次調查結果來看, 古交市大豆胞囊線蟲發生普遍, 2號和 4號小種分別占57.7%和 42.3%, 除 2份 4號小種被進一步鑒定為X12外, 未檢測到其他類型的生理小種。在邢家社采集的樣本本次鑒定結果仍是 X12, 在生理小種分布圖中標為 1; 另一個鑒定為 X12的是在古交市河口鎮采集的樣本, 在生理小種分布圖中標記為2 (圖1); 另外有3個樣本, 其線蟲群體可以在興縣灰皮支上寄生, 但尚未使興縣灰皮支達到感病水平, 這 3個樣本的采集地點在生理小種分布圖中分別標記為5、21、27, 推測這3個采集地點SCN群體有可能會優先發展為 X12小種。以上研究結果表明, 在不同地點發現了 X12群體; 在X12周圍僅存在2號、4號小種; 發現 3份能在興縣灰皮支上寄生的 4號SCN群體, 但是尚未達到感病水平。

在這 26份鑒定出生理小種類型的樣本中, 其SCN群體均能在Peking、Pickett和PI88788上成功寄生。而且在Peking和 PI88788寄生的FI大于50的SCN群體分別占73.1%和57.7%, Peking和PI88788是目前被美國廣泛利用的抗源[22]。另外, 在PI88788上的FI高的樣本并不局限于土壤中胞囊蟲卵濃度大的樣本, 在11份通過擴繁胞囊并接種鑒定出生理小種類型的樣本中, 其SCN群體在PI88788上的FI范圍為 26～85。據分析, 田間 SCN群體在 PI88788和Peking上寄生指數的增高, 是由于抗性來自PI88788的有限抗性品種的重復利用[12,23-24]。但就我們所知,目前利用 PI88788抗源培育的抗病品種尚未在山西推廣應用。

3.3 在山西省出現超強致病力大豆胞囊線蟲新小種X12的原因分析

多年來, 山西省一直是感染大豆胞囊線蟲最嚴重的省份, 所以, 目前國內很多優異抗源也來自山西省。但是致病性較強的4號小種集中分布在山西省[4]以及 X12小種在古交市被發現的原因, 尚不明晰。本研究做如下推測: 首先, 土質適宜。2012—2015年調查研究結果表明, 能鑒定出生理小種的土樣集中分布在山西省、河北省和河南黃河沿岸, 這些屬于沙性土壤的地區, 推測是沙性土質適宜大豆胞囊線蟲滋生。其次, 氣候適宜。山西省的氣候適宜線蟲繁殖, 古交市屬于山區, 常年在 7月份均溫 23℃, 平均年降水量 428.60 mm, 這正是胞囊繁殖的季節。因而線蟲群體通過內部多代雜交,從而提高了其致病能力。第三, 在山西省, 目前尚缺乏抗病品種的推廣應用, 是生理小種致病性增強的另一個原因。

3.4 古交市大豆胞囊線蟲生理小種分布特點及其對育種工作的啟示

本研究結果表明, 在古交市僅檢測到了2號、4號和 X12生理小種, 再次表明大豆胞囊線蟲分布有一定的區域性[4,10]。鑒于X12小種的超強致病能力,目前又沒有相應的抗源, 暫時限制了針對 X12小種大豆抗病品種培育工作的開展。為緩解由X12小種擴散帶來的經濟損失, 建議從以下 4個方面開展防御工作: (1)培育多抗品種。鑒于生理小種的交叉分布特點, 培育兼抗 2個或 2個以上生理小種的大豆品種, 在古交市推廣應用; (2)加速抗源篩選。可通過擴大抗源篩選范圍, 比如從大豆資源之外的其他豆科作物、野生豆中進行抗源篩選, 克隆抗病基因, 為培育抵御X12小種的大豆抗病品種提供資源; (3)依據當地政府力量, 引導農戶采取與非豆科作物輪作,適當采用化學劑殺蟲對線蟲進行毒殺, 即便付出更高的經濟代價, 也要對已經發展為 X12或會優先發展為X12的群體的田塊進行防治, 以限制X12群體致病性的進一步升級和擴散; (4)定期調查古交市SCN生理小種分布。

4 結論

古交市大豆胞囊線蟲分布廣泛、田間受害嚴重。經調查所有田塊均有大豆胞囊線蟲分布; 本次調查研究發現, 在 X12首次發現地點邢家社周圍集中分布有 2號和 4號小種, 此次調查在河口鎮也發現了X12小種群體, 且有3個地點的SCN群體有可能會優先發展為 X12小種; 當前應采取強有力的輪作措施或使用化學殺蟲劑方案, 限制X12小種的擴散。