抗根腫病甘藍型油菜新品種華油雜62R的選育

李 倩 Nadil Shah 周元委 侯照科 龔建芳 劉 玨 尚政偉 張 磊 戰宗祥 常海濱 傅廷棟 樸鐘云 張椿雨,*

1 華中農業大學植物科學技術學院, 湖北武漢 430070; 2 宜昌市農業科學研究院, 湖北宜昌 443000; 3 德宏傣族景頗族自治州農業技術推廣中心, 云南德宏 678400; 4 黃岡市農業科學研究院, 湖北黃岡 438000; 5 沈陽農業大學園藝學院, 遼寧沈陽 110000

根腫病是由蕓薹根腫菌(Plamodiophora brassicaeWoron)侵染引起的一種世界性土傳病害。該病原菌專性侵染十字花科植物, 包括油菜、大白菜、小白菜、甘藍、蘿卜、花椰菜、芥菜等在內的多種栽培和野生種[1]。被該病原菌侵染后, 植物根系細胞經過非正常擴增和分裂, 從而產生腫瘤, 導致營養與水分的吸收被限制, 地上部分植株發黃并枯萎, 生長發育不良, 作物產量和品質均受到嚴重影響。根腫菌休眠孢子在土壤中存活時間長(可長達 15年以上), 其傳染性強、傳播途徑廣、傳播速度快、防治難度大[2-4]。十字花科油菜是我國最重要的油料作物,長江流域常年種植面積約 667萬公頃, 所產優質菜籽油占國產植物油的 50%以上。近年, 我國油菜生產受根腫病影響較大, 據不完全統計發病面積約在66.7萬公頃(約占總種植面積的10%), 并且隨著機械化程度的不斷提高, 油菜根腫病在我國有大面積爆發的趨勢, 特別是我國所有甘藍型油菜品種均不抗根腫病, 因此油菜產業面臨嚴重威脅。

已有研究表明, 選育并種植抗病品種是防治根腫病最經濟、最有效的途徑。目前應用最廣泛的根腫病抗源材料主要為歐洲飼用蕪菁(Brassica rapassp.rapifera, AA, 2n=20), 包括‘ECD01-04’、‘Gelria R’、‘Siloga’、‘Debra’以及‘Milan White’等[5-6]。日韓等國研究人員以蕪菁為抗源材料, 培育出一些抗根腫病的大白菜品種。進一步在白菜中QTL定位了多個抗病位點, 主要包括Crr1、Crr2、Crr3、Crr4、CRa、CRb、CRc、CRk等[7-9], 這些位點分布在不同的染色體上。目前已成功分離克隆的位點有CRa與Crr1a, 這 2個基因均編碼 TIR-NB-LRR結構蛋白,能夠識別病原菌并引起植物的免疫反應[10-11]。CRa與CRb均定位于 A03染色體, 物理位置緊密連鎖,最新研究認為CRa和CRb是同一個抗病位點[12]。

由于國外油菜根腫病發生較早, 在抗病育種方面也率先取得了一些進展。Diederichsen等[13]利用抗病蕪菁和抗病甘藍材料進行種間雜交, 人工合成了抗病甘藍型油菜品種 Mendel, 經室內和田間抗病性鑒定均表現抗病, 并發現該抗性至少由 2個不連鎖的顯性基因控制。加拿大在油菜抗根腫病育種方面也開展了一些工作, 培育出了油菜抗病新品種[14]。我國油菜抗根腫病的育種工作起步較晚, 主要集中在對現有主栽品種或資源材料的抗病性篩選方面[15-18],而利用蕪菁等高抗資源材料改良我國油菜品種的工作還鮮有報道。本實驗室戰宗祥博士等人以含多個抗病位點的蕪菁ECD04為父本與優良甘藍型油菜常規品種華雙 5號雜交, 結合回交育種策略及分子標記輔助選擇手段, 成功將 ECD04中的抗病位點PbBa8.1轉育到優良油菜常規品種華雙5號中, 育成了我國首個抗根腫病甘藍型油菜常規新品系[19]。

本研究以含有CRb抗病位點, 對多種生理小種(2、4、7、10號)均具較好抗性的大白菜 CR Shinki為供體父本, 與國審甘藍型油菜優良雜交種華油雜62的波里馬恢復系Bing409為母本, 通過雜交、回交以及分子標記輔助選擇和抗病性鑒定等策略, 將CRb抗病位點精準導入到Bing409中, 創建了抗根腫病的新恢復系 Bing409R, 并在此基礎上配制了抗根腫病雜交油菜新品種華油雜 62R, 為抵抗油菜根腫病, 穩定和保障我國油菜產業持續健康發展提供有力保障。

1 材料與方法

1.1 材料

供體親本(父本)為含有CRb位點(位于 A03染色體)的抗根腫病大白菜材料 CR Shinki (AA,2n=20), 根據威廉姆斯寄主鑒別系統鑒定結果, 該位點對根腫菌2號、4號、7號和10號生理小種具有優異抗性; 感病輪回親本(母本)為波里馬細胞質雄性不育(Pol.CMS)三系雜交種華油雜62 (國審)的恢復系Bing409, 同時在本研究作為感病對照材料。

1.2 方法

1.2.1 技術路線 親本材料于2013年10月種植于沈陽農業大學日光溫室, 2014年2月完成授粉獲得F1, 并利用4號生理小種進行室內接菌鑒定。2014年5月于沈陽農業大學播種, 8月完成F1代植物的回交, 10月獲得含有492株單株的BC1群體。為加快育種進程, 從 BC1代開始, 利用與抗病位點CRb緊密連鎖的分子標記進行前景選擇篩選含有CRb位點的單株, 淘汰無CRb的植株; 再利用均勻覆蓋甘藍型油菜A基因組的123個多態性標記(附表1), 對含CRb抗病前景位點的植株進行遺傳背景篩選, 保留背景回復率高的植株。經過3次回交1次自交后, 于2016年春獲得CRb位點純合、背景恢復率在95%以上的抗病植株, 命名為Bing409R。2016年夏繁, 利用華油雜62的不育系與Bing409R配制了抗病新組合(命名為華油雜62R), 于2016年秋將Bing409R和華油雜 62R種植在不同病區(枝江、黃山等)進行田間抗病性鑒定。技術路線如圖1所示。

1.2.2 根腫病溫室接種體系 溫室接種采用菌土法接種。取出-20℃保存的油菜病根, 室溫下解凍稱量并用勻漿機磨碎, 與風干的草炭土按照 1∶20的比例混勻, 25℃密封保存48 h以上[20]。將培養土裝到 50孔穴盤中并灌足底水, 少量菌土放到穴盤中后, 在菌土上播種1～2粒種子, 25℃培養, 6周后進行表型鑒定并分級。0級為沒有根瘤, 1級在側根處有小根瘤, 2級在主根側根處有較小根瘤, 3級在主根側根有較大根瘤, 4級在主根側根有較大的明顯根瘤[21]。

1.2.3 根腫病田間接種及表型鑒定 田間表型鑒定通過選取近幾年發病嚴重且相對比較均一的田塊為病圃, 直接分成不同的小區進行直播, 一般在 9月下旬播種, 并于6～10周后或在感病對照組有明顯受害表型時開始進行表型鑒定, 發病等級劃分標準與室內接種相同。

1.2.4 病情指數 病株率(%) = 發病株數/調查總株數×100; 病情指數 = ∑(病株數×相應病害級別)/(調查總株數×最高級別) × 100。校正系數K= 50/對照品種的實際病情指數; 相對病情指數 =K×鑒定材料的病情指數。品種資源的抗病性差異根據相對病情指數進行分類: 免疫(I) = 0; 0<高抗 HR≤5;5<抗 R≤10; 10<中抗 MR≤20; 20<中感 MS≤30;30<感病 S≤50; 50<高感HS≤100[21]。

1.2.5 DNA提取及 PCR程序 利用改良 CTAB法提取親本和各世代單株幼嫩葉片DNA, 10 μL的PCR的反應體系, 包含2 ng的DNA模板、正向反向引物各 250 nmol L-1、0.25 nmol L-1dNTP、1 μLTaq酶。PCR反應條件為94℃預變性3 min; 94℃ 1 min, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35個循環; 72℃ 10 min;10℃ 保存。PCR產物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳, 結束后進行銀染、顯影。

1.2.6 前景選擇 用于CRb抗病位點前景選擇的標記由沈陽農業大學樸鐘云教授課題組提供或本實驗室開發, Pol.CMS恢復基因前景選擇標記由華中農業大學易斌教授提供。經過兩親本間多態性檢測,選擇具有多態性的分子標記進行前景選擇(表1), 其中 CRb_ssr541、CRb_ssr01和 CRb_ssr413是位于CRb抗病位點兩側的連鎖標記, Rfp_ssr52和Rfp_rt5標記分別是與甘藍型油菜Pol.CMS恢復基因Rfp的連鎖的分子標記和功能標記[22]。需要說明的是, 每一代回交分離群體中含有前景抗病位點CRb的個體,其恢復基因Rfp都需要進行標記選擇, 保留同時具有CRb及Rfp的個體, 繼續進行遺傳背景篩選, 故本文將Rfp位點的篩選歸在前景選擇中。

表1 CRb抗病位點及Rfp恢復基因連鎖標記Table 1 Linkage markers of CRb resistant locus and Pol.CMS restore gene Rfp

1.2.7 背景選擇 在親本材料 Bing409與 CR Shinki中篩選出了 225對多態性標記, 通過本地BLAST, 篩選得到物理位置均勻分布于油菜A基因組的124對標記, 且相鄰標記間平均物理距離2 Mb左右, 用于回交群體背景回復率鑒定(表2, 附表1)。

遺傳背景回復率 = 基因型恢復到輪回親本背景的標記數/總共標記數。

表2 均勻覆蓋甘藍型油菜A基因組的標記統計Table 2 Uniformly covered markers on genome A of B. napus

1.2.8 農藝性狀測定與測驗 2017—2018年度,在黃岡市農業科學院梅家墩試驗農場(非根腫病發病區)進行油菜品種產量及主要農藝性狀分析試驗。供試品種為根腫病抗病品種華油雜62R, 對照品種為長江中游優異品種華油雜12, 每個品種各種植3個重復, 小區面積20 m2。考察的主要產量性狀包括株高、有效分枝數、單株有效角果、每角粒數、千粒重及單株產量等, 每一性狀每個重復調查植株15株,最后實測小區產量。采用近紅外分析儀檢測的方法測定含油量、芥酸及硫苷含量等油菜品質。

2 結果與分析

2.1 F1及BC1的獲得、分子標記檢測及抗病性鑒定

以國審甘藍型油菜雜交種華油雜 62的 Pol.CMS恢復系 Bing409為母本與含CRb抗病位點的CR shinki為父本, 雜交獲得F1, 以Bing409為輪回親本回交獲得了 BC1代材料。先后對 F1、BC1及兩親本以根腫菌 4號生理小種在溫室進行接種鑒定,接種40 d后調查上述材料的根部受侵染情況, 不同發病等級株數統計見附表2。

對F1表型鑒定發現, F1對4號生理小種表現出100%抗病, 病情指數為0, 與抗病父本CR shinki表型一致, 而輪回親本材料 Bing409則表現出極度感病, 發病指數高達93.6% (圖2-a, b)。表明CR shinki中所含的CRb抗病位點對根腫菌4號生理小種表現為顯性抗病。

對 BC1群體各單株的表型鑒定時發現, 發病等級呈現出兩極分布, 分別為抗病(0級, 24株)以及感病(4級, 19株)(圖2-c, d)。卡方測驗結果顯示, BC1群體抗病、感病分離比符合 1∶1分離(N=43, χ2=0.58 < χ20.05(1)= 3.84), 符合理論預期。用連鎖標記CRb_ssr413(表 1)對以上植株進行基因型鑒定(圖 2-e),其中 A、H、B分別代表 Bing409基因型、雜合基因型、抗病CR Shinki基因型。表明BC1群體中所有感病植株的基因型均為 A, 抗病植株基因型均為H, 基因型鑒定結果與表型一致。F1及BC1代群體分子鑒定和接種鑒定的結果都表明,CRb抗病位點對我國油菜疫區的 4號優勢生理小種為顯性抗病遺傳。

2.2 利用分子標記對 BC1F1～BC3F1各世代株系的前景和背景篩選

利用與抗病位點連鎖標記, 對 BC1F1～BC3F1群體進行前景選擇, 篩選出含CRb抗病位點的植株,然后利用附表 1中所列的分子標記對這些單株進行遺傳背景分析, 根據每一個標記基因型計算并統計遺傳背景回復率, 每一代保留遺傳背景回復率較高的株系繼續進行回交。圖3是BC1F1～BC3F1代含抗病位點的入選株系的遺傳背景回復率從低到高排列的柱形圖。本試驗中 BC1群體背景回復率在0.29～0.71之間, 均值為 0.49, 低于 BC1群體的理論恢復率 75%。BC2F1入選單株背景回復率在0.73～0.93 之間, BC3F1在 0.87～0.97之間。

表3列出了BC1～BC3代各群體單株數、含CRb位點的株數及最后保留的較高遺傳背景的單株數。BC1選擇輪回親本基因組回復率>60%的5個單株編號分別為 438A、65B、128C、464D、94E, 繼續進行下一代回交。由 438A回交群體(含 46株)、65B回交群體(含68株)、128C回交群體(含118株)組成的 BC2群體共 232株, 經過前景和背景篩選獲得了含有CRb位點、輪回親本基因組回復率>90%的 4個株系, 編號分別為438A1、65B1、65B2和65B3, 各自對應的背景回復率分別為92%、92%、91%和91%。其中, 編號464D和94E的回交后代只進行了抗病位點前景選擇, 未進行背景篩選。438A1、65B1、65B2和65B3這4個株系繼續回交, 獲得了BC3后代總共267株, 經過同樣的篩選, 獲得含CRb位點、輪回親本基因組背景回復率高達 97%的 2個單株, 分別為438A1-1和65B2-2。

2.3 高世代當選株系抗病性鑒定、分子標記分析及主要品質性狀檢測

2.3.1 高世代分離群體抗病性鑒定及恢復基因的分子檢測 本研究在對 BC3F1回交后代進行分子標記檢測之前, 隨機抽取了編號為65B2的BC3F1回交后代用4號生理小種進行了接種鑒定。抗病性鑒定結果顯示, BC3F1分離群體中含CRb雜合抗病位點的(H基因型)材料對 4號生理小種表現出免疫抗病性(R, 24株), 不含CRb位點的材料(A基因型)的均為感病表型(S, 19株), 抗感基因型與表型相對應(圖4-a, b, c), BC3F1抗感表型分離比符合1∶1分離(N=43, χ2= 0.58 < χ20.05(1)= 3.84), 這一結果與 BC1群體的鑒定結果相吻合。由此可見, 該連鎖標記能夠準確鑒定抗病位點, 不用每一代都進行抗病性鑒定,以有效節省時間。

隨后, 利用與波里馬恢復基因連鎖標記Rfp-ssr52[22], 對65B2的BC3F1回交后代中分離出的部分抗病單株(30株)的基因型進行檢測。結果如圖4-d所示, 這些單株的基因型均與輪回親本Bing409的基因型一致(A)。最后將經過抗病性鑒定及恢復基因位點鑒定、遺傳背景回復率高的抗病單株65B2-2經自交獲得了純合抗病株系, 并正式命名為Bing409R。

表3 BC1～BC3各世代前景及背景選擇概況Table 3 Detail of foreground and background selection in BC1 to BC3

2.3.2 抗病近等基因系材料 Bing409R對不同生理小種的抗性評價 本研究在選育 Bing409R的過程中, 主要選取了根腫菌 4號生理小種進行抗性鑒定, 為了增加結果的可靠性, 還選取了我國油菜根腫病發病較為嚴重地區的根腫菌, 包括云南、四川、湖北、安徽等省, 對Bing409R進行接菌鑒定。接種我國不同地區根腫菌株數統計見附表 3, 表型調查結果見表4。Bing409R對湖北宜昌和枝江、安徽黃山以及四川省不同地區的根腫菌均表現出免疫抗性(I); 對云南不同地區根腫菌的抗性存在較大差異,分別表現為免疫抗性(I)、抗(R)、中抗(MR)、中感(MS)和高感(HS)等表型; 對湖北恩施巴東的根腫菌表現為高感(HS)。說明我國根腫病生理小種的類型是多樣的, 四川地區根腫菌生理小種比較單一, 而云南地區生理小種種類復雜多樣。這一結果的獲得可為抗病品種的合理應用提供重要依據。

2.3.3 Bing409R不同株系的籽粒品質檢測 隨機選取65B2-2自交后代衍生出的BC3F2純合抗病株系自交種子(共9個系, 編號分別為622-22、622-37、622-30、624-04、625-17、630-11、18ZP06、18ZP07和18ZP08), 利用近紅外分析儀進行品質檢測。由表5可知, 所有被檢測株系含油量均與未改良的輪回親本Bing409 (409S01、409S02和409S03為Bing409不同株系的3個重復)相當, 芥酸及硫苷含量都符合我國“雙低油菜”的生產標準。

2.4 華油雜62R的田間根腫病抗性鑒定

表4 Bing409R抗病材料對我國不同地區根腫菌的抗性評價Table 4 Evaluation of resistance of Bing409R to P. brassica in different regions of China

表5 BC3F3不同抗病株系品質測定Table 5 Seeds quality determination of different resistant lines derived from BC3F3 generation

2016年夏, 將華油雜62的不育系與Bing409R配制了雜交組合, 正式命名為華油雜62R。收獲的華油雜62R分別于2016年秋種植于湖北枝江和安徽黃山病區進行抗病性鑒定。苗期(播種后約2個月)田間抗性調查發現, Bing409R及華雜62R在黃山地區表現出全抗(各調查 60株), 而對照材料 Bing409發病率100% (調查40株); Bing409R及華油雜62R在枝江地區也表現全抗(各調查 80株); 進一步基因型分析表明, F1植株(隨機檢測12株)及Bing409R植株(隨機檢測 7株)均含有CRb抗病位點, 而感病對照Bing409 (隨機檢測12株)均不含有該位點(圖5)。苗后期(播種后約3個半月), 在枝江病區華雜62R與當地不抗病主推對照品種相比, 表現出極強抗性且田間長勢強, 明顯優于對照(圖6)。

2.5 抗根腫病新品種華油雜 62R的產量及農藝性狀測試

2017—2018年度, 在黃岡市農業科學院梅家墩試驗農場進行了根腫病抗病新品種華油雜 62R的產量及主要農藝性狀考察, 以長江中游優良品種華油雜12號為對照, 每個品種各種植3個重復, 小區面積 20 m2, 考察主要與產量相關的農藝性狀并測定小區產量, 每一性狀調查植株15株。株高、有效分枝數、單株有效角果、每角粒數、千粒重、單株產量等主要產量性狀的考察結果如表6所示, 其中株高、每角粒數均低于對照華油雜12, 單株有效角果數及千粒重均高于對照華油雜 12, 單株產量與對照相比無差異。華油雜62R的小區產量與對照品種華油雜12相比基本相當, 折合單產3183.5 kg hm–2。由此可見, 華油雜 62R不僅對根腫菌 4號生理小種表現出免疫抗性, 并且還表現出較高的產量生產能力。

表6 抗根腫病雜交種華油雜62R主要產量性狀考察及小區產量測定Table 6 Examination of main yield characteristics and determination of yield of clubroot resistant hybrid Huayouza 62R

3 討論

本研究以抗根腫病大白菜CR Shinki為供體, 通過遠緣雜交和分子標記篩選, 成功地將甘藍型油菜國審三系雜交種華油雜62的恢復系Bing409進行了抗性改良(命名為Bing409R)。在改良過程中, 從BC1代開始采用對抗病位點和遺傳背景篩選, 并結合適當表型鑒定的策略, 極大縮短了育種時間, 顯著提高了育種效率。然后, 以此為基礎利用Bing409R與華油雜62的波里馬不育系配制雜交組合, 成功選育了甘藍型油菜抗根腫病雜交新品種華油雜62R, 并完成了品種登記(GDP油菜(2018) 420213), 為我國選育的第一個抗根腫病油菜雜交種。近年來, 我國油菜根腫病的發生面積逐年擴大, 重災區主要分布在四川、湖北、安徽等地[23], 室內及病區接菌鑒定結果表明, 華油雜62R對我國油菜主產區四川、湖北、安徽等地的根腫菌具免疫或高抗抗性。因此該品種應用范圍較大, 產量水平較高, 如在安徽績溪發病田塊產量可達 3000 kg hm–2以上, 因此其應用前景廣闊。近年來, 雖然華油雜 62R年推廣面積在30,000～50,000 hm2左右, 但仍遠遠不能滿足油菜生產的需要, 目前全國主要油菜育種單位利用這個抗源正在加緊抗病新品種的選育工作, 這對保障我國油菜產業免受油菜根腫病的威脅具有重要意義。

根腫病菌是十字花科專性寄生菌, 生理小種多樣, 長期種植含單一抗病基因的品種容易造成抗性喪失[24]。因此, 未來將不同的抗病位點如CRb與PbBa8.1[19]進行聚合, 可培育出對根腫病多個生理小種同時具有抗性的優良油菜品種, 以降低品種抗性喪失的風險。今后, 還需要加大不同抗源材料的創制力度, 以增加抗病基因的遺傳多樣性, 為抗病位點聚合育種奠定堅實基礎。

4 結論

通過對雜交、回交及自交等育種程序, 結合前景和遺傳背景的分子標記輔助篩選, 將CRb根腫病抗病位點導入到甘藍型油菜國審品種華油雜 62的父本Pol CMS恢復系Bing409中; 在改良了波里馬恢復系 Bing409根腫病抗性的基礎上, 選育了我國第一個抗根腫病油菜雜交新品種華油雜 62R。根腫病抗病性遺傳改良并未對抗病新恢復系 Bing409R及由其配制的雜交種華油雜62R的產量、品質造成不良影響; Bing409R及華油雜62R對我國四川、湖北、安徽等地區根腫菌生理小種具有免疫抗性。本研究的開展, 為我國油菜抗根腫病育種提供了寶貴的資源, 為我國抵抗油菜根腫病的威脅提供了重要支撐。

附表1 用于遺傳背景篩選的多態性分子標記Table S1 Polymorphic molecular markers used for genetic background screening

(續附表 1)

(續附表 1)

(續附表 1)

附表2 F1、BC1及兩親本的發病率統計Table S2 Number of plants of F1, BC1, and two parents at different disease resistant levels

附表3 Bing409R抗病材料接種我國不同地區根腫菌株數統計Table S3 Number of resistant materials Bing409R inoculated with P. brassica in different areas of China