基于網絡藥理學和分子對接探討青龍衣治療白癜風的物質基礎及作用機制

何 婷，王亞楠，王銀潔，謝寶琳，徐 靜，楊麗娟，莫 婷，楊 森，馬 力，高如宏

(1.寧夏回族醫藥研究所；2.銀川市興慶區健康教育所；3.銀川市中醫醫院，寧夏 銀川 750021；4.廣州中醫藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006)

青龍衣即核桃(JuglansregiaL./JuglansmandshuricaMaxim.)的外果皮，始載于《開寶本草》。青龍衣苦、澀、平，主治脘腹疼痛、泄瀉久痢、癰腫瘡毒、頑癬、禿瘡、白癜風等癥[1]。青龍衣治療白癜風在古今醫書中均有記載，《本草綱目》曰：“治白癜風：青胡桃皮一個，硫黃一皂子大。研勻，日日摻之，取效。”回醫藥經典著作《回回藥方》也提到：“青胡桃皮，白礬，荊棘樹膠，合用治療渾身紫白癜風用?！盵2]近代亦有臨床文獻報道使用青龍衣治療白癜風疾病[3-4]。但青龍衣治療白癜風的物質基礎及作用機制并不明確，且未見相關研究報道。因此，本研究利用網絡藥理學[5]的方法篩選青龍衣治療白癜風的關鍵活性成分，探討其關鍵作用靶點和通路，通過分子對接進一步驗證關鍵靶點，初步闡明青龍衣治療白癜風的物質基礎和作用機制，以期為后續實驗研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 青龍衣活性成分篩選

通過中國知網(CNKI)、PubMed等數據庫進行文獻檢索，收集青龍衣化學成分，再利用Pubchem、sci-finder等數據庫對其結構進行確證，構建化學成分庫。用ChemBioDraw Ultar 14.0 將化合物的結構式保存為sdf格式。利用molsof軟件(http：//molsoft.com/mprop/)，得到各成分的ADME 參數即吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代謝(Metabolism)及排泄(Excretion)，參數包括OB(Oral bioavailability)、DL(Druglikeness)等。由于青龍衣治療白癜風為外用劑型，因此以類藥性DL≥0.18[6]作為活性成分篩選條件。

1.2 青龍衣活性成分作用靶點收集

Swiss Target Prediction(http：//www.swiss targetprediction.ch/)是基于小分子化合物結構，從2D及3D結構相似性角度，間接預測提交小分子化合物的作用靶點[7]。將“1.1”項下得到的青龍衣活性成分sdf格式導入Swiss target prediction平臺，設置種屬為“homo sapiens”，進行反向對接，預測青龍衣活性成分作用靶點，選取每個化合物的前15個靶點[8]。

1.3 白癜風疾病相關靶點收集

以白癜風、vitiligo為關鍵詞，分別從TTD數據庫(https：//db.idrblab.org/ttd/)，OMIM數據庫(https：//omim.org/)，Genecards數據庫(https：//www.genecards.org/)收集白癜風疾病相關靶點。設定物種為“人類(Homo sapiens)”，去掉重復后，建立白癜風疾病相關靶點數據庫。

1.4 蛋白相互作用(PPI)網絡構建與分析

蛋白互作網絡(Protein-protein interaction network，PPI network)可幫助預測蛋白質之間的潛在相互作用，有助于從系統角度研究疾病分子機制、發現新藥靶點[9]。STRING 數據庫(http：//string-db.org)可評估、整合蛋白-蛋白之間的相互作用，包括直接和間接關聯[10]。為明確青龍衣化學成分與治療白癜風靶點之間潛在的相互作用關系，將“1.2”項下篩選出的青龍衣活性成分靶點和“1.3”項下篩選出的白癜風靶點導入 STRING 數據庫，限定物種為人類(Homo sapiens)，設置較高置信度(High confidence)≥0.70，除去未相互連接的節點(Node)后，得到靶點互作網絡圖，保存為TSV格式文件。將TSV導入Cytoscape 3.7.1中，運用CentiScaPe 2.2計算節點度值(Degree)，選取度值大于平均值兩倍的靶點作為核心靶點(Hub node)[11]。

1.5 青龍衣治療白癜風靶點篩選

將“1.2”項下得到的青龍衣活性成分靶點，與“1.3”項下得到的白癜風靶點進行交集，作為青龍衣治療白癜風的直接靶點。將“1.3”項下白癜風靶點與“1.4”項下得到的核心節點(Hub node)取交集作為間接靶點，合并直接靶點與間接靶點，即得青龍衣治療白癜風所有可能的作用靶點，利用Venny2.1.0 軟件，繪制韋恩圖。

1.6 GO功能富集分析

DAVID數據庫是強大的基因注釋工具，可通過該數據庫發掘基因與疾病的相關性，并對相關基因進行富集分析[12]。將“1.5”項下得到的青龍衣治療白癜風靶點輸入DAVID 6.7數據庫(https：//david-d.ncifcrf.gov/summary.jsp)進行GO功能富集分析。限定物種為人類(Homo sapiens)，分別選取生物過程(BP)、細胞組分(CC)、分子功能(MF)以P值升序排列的前10個富集過程，利用GraphGad Prinsm 7繪制GO 2級分類柱狀圖[13]。

1.7 青龍衣“關鍵成分-關鍵靶點”網絡構建

將“1.1”項下得到的青龍衣活性成分和“1.5”項下得到的治療白癜風靶點通過Cytoscape 3.7.1軟件構建“關鍵成分-關鍵靶點”網絡，并運用軟件中的CentiScaPe 2.2進行拓撲分析，計算介數中心度(Betweenness centrality)，緊密中心度(Closeness centrality)和節點度值(Degree)，根據3項數值，以均大于中位數的標準篩選青龍衣治療白癜風的關鍵活性成分和關鍵作用靶點[14]。

1.8 分子對接驗證

本研究采用薛定諤軟件中Maestro的Glide進行對接。從RCSD PDB (http：//www.rcsb.org/)蛋白數據庫搜集靶點的蛋白晶體結構[15]，從PubChem Compound(http：//www.ncbi.nlm.gov)下載靶點化合物的sdf格式，準備對接。用Protein Prepare Wizard對蛋白質晶體進行預處理，用LigPrep模塊對靶點化合物結構優化，最后用標準精密(Standard precision，SP)分子對接，對接分數(Docking score)絕對值越大，表示結合親和力越強[16]。將PDB蛋白晶體結構中已有配體作為陽性對照，其與相應靶點PDB蛋白的對接分數為截斷值，打分高于截斷值的化合物則認為與該蛋白具有較好的結合親和力。以RMSD<2[17]為閾值評判對接方法的合理性。

2 結果

2.1 青龍衣活性成分篩選

對數據庫檢索結果進行整理，共收集到92個青龍衣化學成分，符合“DL≥0.18” 的有79個即為青龍衣活性成分，主要集中于萘醌類、二芳基庚烷類、多酚類、萜類、黃酮類等化合物。

2.2 青龍衣活性成分作用靶點篩選

將篩選到的活性成分，輸入Swiss Target Prediction 網站進行反向對接，去重復后得到342個活性成分作用靶點。

2.3 白癜風疾病靶點篩選

從TTD數據庫中得到9個靶點，OMIM數據庫得到1個靶點，Genecards數據庫得到783個靶點，去重復后得到790個白癜風疾病靶點。

2.4 PPI網絡分析

將STRING數據庫得到的蛋白相互作用信息導入Cytoscape進行拓撲分析，結果發現與白癜風發生、發展密切相關的靶蛋白ESR1、EGFR、CXCL8、IL2、JAK2等80個靶點的度(Degree)值均在中位數的2倍以上，表明這些蛋白在PPI網絡中具有關鍵地位，對青龍衣治療白癜風具有重要意義。

2.5 將青龍衣活性成分對應靶點與白癜風疾病靶點相交集

通過軟件Venny2.1.0映射，得到共有直接靶點47個。通過STRING數據庫進行蛋白-蛋白相互作用分析，共得到89個核心節點(Hub node)。將化合物靶點與核心節點(Hub node)相交集共得到間接靶點32個，最終確定79個青龍衣治療白癜風潛在作用靶點，繪制維恩圖(見圖1)。

圖1 青龍衣治療白癜風的直接與間接作用靶點

2.6 功能注釋與通路分析

通過DAVID數據庫，對青龍衣化學成分的對應靶基因進行GO功能注釋分析(見圖2)。GO結果顯示79個潛在靶點主要涉及159個GO功能，其中生物過程(BP)富集142個功能過程，主要涉及細胞內信號級聯、磷酸鹽代謝過程、氮化合物代謝過程的正調控等；細胞組分(CC)相關的富集過程1個，為胞漿過程；分子功能(MF)相關的富集過程15個，主要涉及腺苷酸結合、酶結合、胰島素受體底物結合一氧化氮合酶調節活性、非膜生成蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性等過程。

注：BP：生物過程；CC：細胞組分；MF：分子功能。圖2 青龍衣治療白癜風關鍵靶點的GO富集

2.7 “關鍵成分-關鍵靶點”網絡構建

利用Cytoscape對青龍衣活性成分和治療白癜風靶點進行拓撲結構分析，篩選出關鍵活性成分21個，關鍵靶點27個(見表1)。

表1 青龍衣治療白癜風的關鍵活性成分和關鍵靶點

續表1

2.8 分子對接驗證

通過文獻調研發現，BCL2、EGFR、ESR、ACHE、MAOA、PTPN22(表1加粗)這幾個關鍵靶點與白癲風的發生、發展密切相關，且為目前研究熱點；另外醌類化合物為青龍衣的特征化學成分，其含量也較高，可能為青龍衣的藥效成分，故選擇6個醌類關鍵活性成分與以上靶點進行分子對接驗證。各個靶點PDB蛋白與對應關鍵活性成分的分子對接得分見表2。

表2 關鍵活性成分與關鍵靶點的對接得分

2.8.1 ESR1靶點與關鍵活性成分分子對接 結果顯示，ESR1與1,3-二羥基-2-甲氧基蒽醌、1,3-二羥基蒽醌、1-甲基-3,8-二羥基-6-甲氧基蒽醌的對接得分優于配體(見表2)，且均與ESR1的殘基GLU353和LEU387形成氫鍵相互連接，說明化合物與靶點之間有較強的活性，ESR1可能是這3個關鍵活性成分的作用靶點。見圖3、圖4、圖5。

圖3 1,3-二羥基-2-甲氧基蒽醌與ESR1活性位點對接的3D(a)和2D(b)

圖4 1,3-二羥基蒽醌與ESR1活性位點對接的3D(a)和2D(b)

圖5 1-甲基-3,8-二羥基-6-甲氧基蒽醌與ESR1活性位點對接的3D(a)和2D(b)

2.8.2 MAOA與關鍵活性成分分子對接 結果顯示，MAOA與胡桃醌以及2,3-二甲基-5-羥基-1,4-萘醌的對接得分優于配體(見表2)，且均通過氫鍵與MAOA殘基ASN181相互作用，說明MAOA可能是這兩個關鍵活性成分的作用靶點。見圖6、圖7。

圖6 2,3-二甲基-5-羥基-1,4-萘醌與MAOA活性位點對接的3D(a)和2D(b)

圖7 胡桃醌與MAOA活性位點對接的3D(a)和2D(b)

2.8.3 PTPN22與關鍵活性成分的分子對接 結果顯示，PTPN22與胡桃醌以及2,3-二氫-5-羥基-1,4-萘醌的對接得分優于配體(見表2)，且均通過pi-pi共軛與PTPN22殘基ARG233相連接，PTPN22殘基ARG233、ALA229與CYS231相互作用形成氫鍵，pi-pi共軛連接和氫鍵連接增強了化合物與靶點蛋白的穩定性，提高了彼此之間的結合親和力，PTPN22可能是這兩個關鍵活性成分的作用靶點。見圖8、圖9。

圖8 2,3-二氫-5-羥基-1,4-萘醌與PTPN22活性位點對接3D(a)和2D(b)

圖9 胡桃醌與PTPN22活性位點對接的3D(a)和2D(b)

2.8.4 BCL2與關鍵活性成分分子對接 結果顯示，BCL2與1,3-二羥基-2-甲氧基蒽醌和1,3-二羥基蒽醌的對接得分均優于配體(見表2)，且均通過pi-pi共軛與BCL2殘基PHE63相連接，通過氫鍵與BCL2殘基ASP70相連接，BCL2可能是這兩個關鍵活性成分的作用靶點。見圖10、圖11。

圖10 1,3-二羥基-2-甲氧基蒽醌與BCL2活性位點對接的3D(a)和2D(b)

2.8.5 EGFR和ACHE與關鍵活性成分分子對接 結果顯示，1,3-二羥基-2-甲氧基蒽醌、1,3-二羥基蒽醌、1-甲基-3,8-二羥基-6-甲氧基蒽醌與EGFR的對接得分低于配體(見表2)，說明化合物與靶點之間的活性較弱，這3個關鍵活性成分的作用靶點可能不是EGFR。同理，2,3-二甲基-5-羥基-1,4-萘醌和2,3-二氫-5-羥基-1,4-萘醌這兩個關鍵活性成分的作用靶點也可能不是ACHE。

3 討論

白癜風是由于某些不明原因造成黑色素細胞損傷，自表皮脫失而形成的白斑。其發病率約為1%～2%，該病治愈率低且復發率高，是世界公認的疑難頑癥。迄今為止，其病因及發病機理尚未闡明[18-19]。青龍衣治療白癜風歷史悠久且臨床效果較好，本研究對其物質基礎和作用機制進行探究，初步得到21個關鍵活性成分和27個關鍵靶點，這些關鍵活性成分主要為二芳基庚烷類、醌類衍生物和黃酮類化學成分。網絡藥理學結果顯示，關鍵活性成分主要作用于ESR1、BCL2、PTPN22、MAOA、EGFR、ACHE等靶點，這些靶點涉及白癜風相關的多種病理因素，如遺傳、神經內分泌、氧化應激、炎癥、凋亡等。

白癜風患者ESR1基因內含子1C/T 等位基因與正常人有顯著性差異[20]。有學者應用含有雌激素的類固醇-甲狀腺激素混合物可成功治療白癜風[21]。雌激素受體1(ESR1，Estrogen Receptor 1)是青龍衣治療白癜風關鍵靶點中綜合評分最高的一個靶點(Degree=17)。網絡藥理學結果顯示青龍衣中的1-羥基-6-甲基蒽醌、1,3-二羥基蒽醌、核桃素A、核桃素C等9個化合物均可能作用于此靶點。分子對接結果進一步驗證了1,3-二羥基-2-甲氧基蒽醌、1,3-二羥基蒽醌、1-甲基-3,8-二羥基-6-甲氧基蒽醌對ESR1的作用活性。

乙酰膽堿酯酶(Acetyl cholinesterase，ACHE)是生物神經傳導中的一種關鍵性酶。白癜風患者表皮中存在ACHE，且活性降低，ACHE的減少導致乙酰膽堿ACh增加，ACh能抑制多巴氧化酶活性，進而抑制黑色素生成，從而加重白癜風患者表皮黑色素脫失[22]。在B16F10小鼠黑色素瘤細胞的黑色素生成過程中，也觀察到ACHE水平顯著降低[23]。另有學者認為，ACHE通過氧化應激途徑誘導細胞色素脫失[24]。網絡藥理學結果顯示，青龍衣中的2,3-二甲基-5-羥基-1,4-萘醌、2,3-二氫-5-羥基-1,4-萘醌、楓楊素等10個化合物均可能作用于此靶點，分子對接結果表明篩選的化合物可能與此靶點作用不強。

單胺氧化酶(Monoamine oxidase A，MAOA)是一種參與多巴胺降解的酶。多巴胺已被證明對黑素細胞有毒性，白癜風患者的多巴胺水平表達升高。研究[25]發現，在活躍期白癜風患者的皮損部位，MAOA的mRNA水平和蛋白水平均顯著增加。網絡藥理學結果顯示，青龍衣中的2,3-二甲基-5-羥基-1,4-萘醌、4-甲氧基-5-羥基-1-四氫萘酮、胡桃醌、槲皮苷、芹菜素5個化合物可能作用于此靶點。分子對接結果進一步驗證了胡桃醌、2,3-二甲基-5-羥基-1,4-萘醌對MAOA的作用活性。

蛋白酪氨酸磷酸酶非受體22型(Protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22，PTPN22)代表了自身免疫性疾病的候選基因[26]。研究[27-28]發現，PTPN22基因中的單核苷酸多態性是白癜風的易感因素，PTPN22+1858C/T等位基因在白癜風患者中出現的頻率顯著高于正常對照，認為是罹患白癜風的危險因素。網絡藥理學結果顯示，青龍衣中的胡桃醌、2,3-二氫-5-羥基-1,4-萘醌、對苯二酚等可能作用于此靶基因。分子對接結果進一步驗證了胡桃醌、2,3-二氫-5-羥基-1,4-萘醌對PTPN22的作用活性。

研究表明，白癜風皮損黑素細胞減少或消失的機制之一可能為細胞凋亡[29]，有實驗發現，白癜風非白斑區黑素細胞凋亡增加的同時，抗凋亡因子BCL2的轉錄和翻譯水平也隨之上調，可能為代償性保護性調節反應[30]。網絡藥理學結果顯示，青龍衣中的1,3-二羥基-2-甲氧基蒽醌、1,3-二羥基蒽醌、大黃素可能作用于BCL2靶點，分子對接結果進一步驗證了1,3-二羥基-2-甲氧基蒽醌和1,3-二羥基蒽醌對BCL2的作用活性。

綜上，白癲風發病機制復雜，青龍衣治療白癲風療效確切，但其作用機制和物質基礎不明確，限制了其應用，本研究基于網絡藥理學研究方法，對青龍衣治療白癜風多成分、多靶點作用方式進行了系統研究，借助分子對接技術進行驗證，初步預測了其藥效物質基礎與作用靶點。青龍衣中主要特征成分醌類成分胡桃醌、1,3-二羥基-2-甲氧基蒽醌、1,3-二羥基蒽醌、1-甲基-3,8-二羥基-6-甲氧基蒽醌、2,3-二甲基-5-羥基-1,4-萘醌、2,3-二氫-5-羥基-1,4-萘醌是青龍衣治療白癲風的物質基礎，其作用靶點可能為ESR1、MAOA，PTPN22，BCL2，其作用機制可能是增加雌激素釋放，降低多巴胺水平，抑制蛋白酪氨酸磷酸酶非受體22型，抑制細胞凋亡。該研究可為青龍衣治療白癜風的后續研究，以及開發治療白癜風的藥物提供依據。