茵陳蒿湯物質基準特征圖譜的建立

杜微波，張志強，萬瑩瑩，陳敬然，沈建梅

(北京康仁堂藥業有限公司，中藥配方顆粒關鍵技術國家地方聯合工程研究中心，北京市中藥配方顆粒工程技術研究中心，北京101301)

茵陳蒿湯出自張仲景所著《傷寒論》[1]，主要由茵陳、大黃和梔子三種成分組成，功效為清熱祛濕、利膽退黃，用于治療濕熱黃疸。現代研究發現，茵陳蒿湯有利濕退黃、促進膽紅素代謝、修復肝損傷等功效。

國家食品藥品監督管理總局在《中藥經典名方復方制劑簡化注冊審批管理規定(征求意見稿)》[2]中明確指出，將經典名方物質基準作為中藥藥用物質標準，依據古代典籍中記載的制備方法制備，經方物質基準應以主要藥效物質為研究基礎，以確保經方制劑與傳統中醫臨床所使用的質量療效一致。因此如何建立經方物質基準藥效的質量評價方法是中醫藥現代化研究的重點，也是開發經方制劑的關鍵通路。

特征圖譜是通過反映中藥化學成分中某些重要的特征信息，進而控制中藥質量的研究方法，能夠確保其內在質量的均一、穩定[3]。因此本研究根據各藥味在處方中的作用，針對各藥味關聯的藥效成分進行目標成分的選取，以期建立能夠真實、全面反映茵陳蒿湯藥效的特征圖譜，以評價經典名方物質基準的質量，為后續的藥物開發及質量控制提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-20A型液相色譜儀，安捷倫1260II型液相色譜儀，十萬分之一電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司BT25S)，萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司MS204TS/02)，千分之一電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司SQP)，超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司 KQ-300DB)。

1.2 材料

沒食子酸(批號：110831-201605，中國食品藥品檢定研究院，純度90.81%)，綠原酸(批號：110753-201617，中國食品藥品檢定研究院，純度91.8%)，秦皮乙素(批號：110741-201708，中國食品藥品檢定研究院，純度99.9%)，梔子苷(批號：110749-201718，中國食品藥品檢定研究院，純度97.6%)，金絲桃苷(批號：111521-201708，中國食品藥品檢定研究院，純度95.7%)，槲皮素(批號：100081-201610，中國食品藥品檢定研究院，純度99.1%)，大黃素(批號：110756-201512，中國食品藥品檢定研究院，純度98.7%)，蘆薈大黃素(批號：110795-201710，中國食品藥品檢定研究院，純度98.3%)，大黃酸(批號：110757-201607，中國食品藥品檢定研究院，純度99.3%)；乙腈(色譜純HPLC)，無水乙醇(分析純AR)，甲醇(分析純AR)，磷酸(色譜純HPLC)，蒸餾水；實驗用飲片均在北京康仁堂藥業有限公司購買，并經過檢測符合藥典標準。

2 方法與結果

2.1 目標物質的選擇

茵陳蒿湯用于治療肝病的一個經典名方，功效為清熱、利濕、退黃。其中君藥為茵陳，有清熱利濕、利膽退黃之功；臣藥為梔子，可泄熱退黃，清解三焦之熱；佐藥大黃，清利濕熱，泄熱通便，化瘀破結。現代藥理研究發現，茵陳蒿湯治療肝病的作用機制主要為修復肝損傷、抗肝纖維化、改善肝脂肪代謝、利膽等[4]。

君藥茵陳主要的化學成分有香豆素、黃酮、有機酸類等。其中有研究表明香豆素類與茵陳保肝作用相關，可以抑制因四氯化碳引起的肝體比的上升，以及阻止血中丙二醛形成及丙氨酸氨基轉移平的升高，具有抗脂質過氧化的作用[5]；有機酸與茵陳清熱利濕、利膽作用相關，有明顯的抗病毒、保肝利膽等作用[6-7]。

臣藥梔子主要成分為環烯醚萜苷類[8]，其中梔子苷存在較強的藥理活性。孫旭群等[9]研究表明：梔子苷與梔子的利膽退黃作用相關，能顯著增加6 h內正常大鼠和肝損傷大鼠的膽汁排泌量，在0.2～1.6 g范圍內其利膽作用的差異顯著，尤其在是給藥2 h和肝損傷模型中表現更為明顯。

佐藥大黃含有蒽衍生物類、有機酸類、黃酮類及其苷類化合物和鞣質類等多種有效成分。研究表明蒽醌類具有保肝降酶作用，通過抑制四氯化碳所致的總蛋白、白蛋白的下降及急性肝損傷小鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶的升高[10]，與大黃保肝作用相關；鞣質則具有較好的自由基活性氧的功能，與大黃瀉熱通便作用相關[11]；黃酮類成分與大黃利濕、保肝作用相關，可降低尿中白蛋白量，對腎病理組織學病變亦有明顯改善作用，降低模型大鼠血清中葡萄糖、尿素氮、肌酸酐、三酰甘油和總膽固醇含量[12]，并對四氯化碳肝損傷的小鼠具有良好的保肝降酶作用。

根據對各藥味的藥理學作用結合茵陳蒿湯中藥味功效及作用機制，確定對茵陳中香豆素類及有機酸、梔子中環烯醚萜苷類、大黃中蒽醌類、黃酮類及鞣質成分進行特征圖譜研究，根據特征圖譜技術要求，采用HPLC法建立茵陳蒿湯基準物質的特征圖譜，以保證能夠全面反映茵陳蒿湯的功效特點。

2.2 色譜條件的選擇

茵陳蒿湯成分中蒽醌類多為小極性成分，環烯醚萜、黃酮、香豆素類多為中極性成分，鞣質、有機酸類多為大極性成分。因此針對特征圖譜目標物質進行文獻檢索，結合統計結果，確定流動相及基本的梯度，進行方法優化，得到茵陳蒿湯物質基準的特征圖譜色譜條件：Agilent-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)色譜柱；檢測波：254 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈(A)-0.05%(B)磷酸溶液。按表1進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 供試品溶液的制備 對茵陳蒿湯物質基準目標物質的極性情況分析可知，其中茵陳、梔子水溶性成分較多，大黃脂溶性成分稍多。分別以水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇作為提取溶媒進行比較，發現30%乙醇特征圖譜的色譜峰信息較豐富，并能夠兼顧物質基準的各類目標物質，因此確定以30%乙醇作為提取溶媒。

采用30%乙醇作為提取溶媒，分別考察不同提取方式(熱回流提取、振搖提取、超聲提取)，在確定提取方式的基礎上對提取時間(15 min、30 min、45 min)進行考察。由比較結果可知，三種不同方式以及提取時間獲得的特征圖譜信息差異不大，考慮到操作便利性以及為保證各類化學成分的提取充分，確定提取方式采用超聲，提取時間為30 min。

綜上，確定供試品溶液的制備方法為：取本品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇溶液25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，稱定重量，用30%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3.2 陰性溶液的制備 根據處方，分別制備缺少茵陳、梔子、大黃的樣品，按照茵陳蒿湯基準物質制備過程制備相應的陰性樣品。取陰性樣品0.5 g，按“2.3.1”項下“供試品溶液制備方法”制備陰性溶液，即得。

2.3.3 對照品溶液的制備 取沒食子酸、綠原酸、秦皮乙素、梔子苷、金絲桃苷、槲皮苷、大黃酸、大黃素對照品適量，精密稱定，置量瓶中，加甲醇制成每1 mL含60μg、40μg、50μg、80μg、100μg、50μg、70μg、70μg的溶液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取茵陳蒿湯物質基準粉末0.5 g，精密稱定，按“2.3”確定的供試品溶液制備方法和“2.2”確定的色譜條件進行操作，連續進樣6次，以綠原酸峰為S峰，計算相對保留時間，各特征峰的相對保留時間RSD小于2%，表明儀器精密度良好。見表2。

表2 精密度試驗結果

2.4.2 重復性試驗 取茵陳蒿湯物質基準粉末0.5 g(共6份)，精密稱定，按“2.3”確定的供試品溶液的制備方法和“2.2”確定的色譜條件進行操作，以綠原酸峰為S峰，計算相對保留時間，各特征峰的相對保留時間RSD小于2%，說明本方法的重復性良好。見表3。

表3 重復性試驗結果

2.4.3 穩定性試驗 取茵陳蒿湯物質基準粉末0.5 g，精密稱定，按“2.3”確定的供試品溶液的制備方法和“2.2”確定的色譜條件進行操作，分別在制備后放置0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣測定，以綠原酸峰為S峰，計算相對保留時間。在24 h內各特征峰的相對保留時間RSD小于2%，供試品溶液中化學成分在24 h內穩定性良好。見表4。

表4 穩定性試驗結果

2.5 共有峰的確定及歸屬

2.5.1 共有峰的確定 測定15批茵陳蒿湯物質基準，使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2012.1版本)，以1號為參照圖譜，按中位數計算，進行共有峰標識，共獲得23個峰，見圖1。

圖1 共有峰標識

2.5.2 共有峰歸屬 將陰性樣品與茵陳蒿湯物質基準的特征圖譜相比較，并對峰進行歸屬。其中12個峰歸屬為茵陳、2個峰歸屬為梔子、7個峰歸屬為大黃，其余為共有峰。見圖2。

注：(1)茵陳蒿湯物質基準；(2)大黃陰性樣品；(3)梔子陰性樣品；(4)茵陳陰性樣品。圖2 茵陳蒿湯物質基準歸屬峰結果

2.5.3 共有峰指認 根據茵陳蒿湯中化學成分，確認了8個特征峰，峰3為沒食子酸、峰4為綠原酸、峰6為秦皮乙素、峰8為梔子苷、峰13為金絲桃苷、峰20為槲皮素、峰22為大黃酸、峰23為大黃素，見圖3。

圖3 茵陳蒿湯基準物質峰指認

2.6 特征峰選取及評價

結合茵陳蒿湯功效成分及峰的峰高、峰形等參數，選取了17個特征峰，見圖4。其中峰1、2、3、5、7、8、9、11、12、13共計10個色譜峰來自于茵陳，占總峰數約58.8%；其中峰4、6共計2個色譜峰來自于梔子，占總峰數約11.8%；其中峰8、10、14、15、16、17共計6個色譜峰來自于大黃(其中峰8與茵陳共有)，占總峰數約47.1%。

圖4 茵陳蒿湯基準物質特征圖譜

根據特征峰的分離及保留時間情況，確定以綠原酸所對應的峰為S峰，并采用相對保留時間對茵陳蒿湯物質基準的特征圖譜進行評價，即：供試品特征圖譜應呈現17個特征峰，與綠原酸峰相應的峰為S峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間，其相對保留時間應在規定值的±10%范圍之內，規定值為0.49(峰1)、0.54(峰2)、1.07(峰4)、1.22(峰5)、1.66(峰6)、2.66(峰7)、2.91(峰8)、2.99(峰9)、3.29(峰10)、4.18(峰11)、4.29(峰12)、4.55(峰13)、5.16(峰14)、5.21(峰15)、5.63(峰16)、5.75(峰17)。

3 討論

本文研究根據茵陳蒿湯處方的功效及各味藥在處方中的作用，篩選出特征圖譜研究的主要目標物質，在色譜條件及供試品溶液制備方法的選擇時均對目標物質情況有針對性地進行了考察，進而建立了茵陳蒿湯物質基準的特征圖譜。對峰進行歸屬，12個峰歸屬為茵陳、2個峰歸屬為梔子、7個峰歸屬為大黃。根據《傷寒論》中記載，茵陳蒿湯處方為：茵陳六兩，梔子14枚，大黃二兩[1]。其中茵陳用量最大、大黃次之、梔子最少，說明本研究特征圖譜反映的成分數量符合茵陳蒿湯方劑特性。

對茵陳蒿湯基準物質的峰進行指認，確定包含綠原酸、秦皮乙素、梔子苷、沒食子酸、大黃酸、大黃素、金絲桃苷、槲皮素等成分。其中茵陳主要的有機酸類成分為綠原酸，具有抗氧化、抗病毒、清除體內自由基以及保肝利膽的作用[13-14]；茵陳主要的香豆素成分為秦皮乙素，能夠降低叔丁基過氧化氫誘導的肝臟病變的發生率，起到保肝作用[15]；梔子主要的環烯醚萜類成分為梔子苷，對四氯化碳引起的小鼠肝臟損傷具有顯著的保護作用，明顯抑制肝臟組織疤痕形成以及膠原沉積[9]；大黃主要的鞣質類成分為沒食子酸，研究表明當質量濃度在50～400ug·mL-1范圍內時，具有明顯的清除一氧化氮、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基以及羥自由基的作用[16]；大黃主要的蒽醌類成分為大黃酸和大黃素[10]，具有瀉下作用，同時也可以降低因四氯化碳所導致的肝損害；大黃主要的黃酮類成分為金絲桃苷和槲皮素，金絲桃苷能通過上調細胞抗氧化酶活性，增強肝細胞的抗氧化能力，從而保護肝細胞因脂質過氧化物而造成的損傷[17]，而槲皮素能夠改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織脂肪變性程度，減輕肝臟炎癥[18]。表明特征圖譜反映的成分與茵陳蒿湯物質基準特征圖譜目標物質的選擇設計相符。

《注冊管理規定》[2]中規定經典名方制劑應與其物質基準的關鍵質量屬性一致，且經典名方物質基準應作為其復方制劑生產工藝路線制定、參數的優化和質量標準制定的參照。因此，制定特征圖譜方法能夠反映中藥經典名方物質基準的功效，是對經典名方制劑減免藥效及臨床試驗政策下臨床療效的保證。

本方法建立的茵陳蒿湯物質基準的特征圖譜能夠反映茵陳蒿湯藥效，可為后續關于茵陳蒿湯制劑的開發及質量控制提供理論依據。