肉桂抗病毒有效部位總糖測定及單糖組成分析

李 瀅，王 麗，郭明里*，李 寧，*，王懷友，張建文，楊兆祥

(1.昆藥集團股份有限公司，云南 昆明 650100；2.香港科技大學深圳研究院 中藥研發中心，廣東 深圳 518057)

中藥肉桂是樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥樹皮，能補火助陽，引火歸元，散寒止痛，溫通經脈[1]。肉桂是我國大宗常用中藥材，同時也是世界聞名的著名香料植物，廣泛應用于食品飲料、日用化妝品、香料工業[2]。因此從肉桂中尋求具有醫藥保健作用的活性分子及分子群不僅是中醫藥領域的熱點，同時也是一個世界性的研究課題。

在中醫藥傳統用法中，肉桂單方用于抗病毒治療的報道不多見。但近年來國外學者報道肉桂的水溶性提取物具有顯著的抗病毒活性[3-4]。該研究引起了我們的關注，我們通過以抗病毒活性為指導的追蹤分離，獲得了肉桂水溶性抗病毒有效部位KPC-rg1[5]。經反復驗證，其抗病毒活性穩定且較國外學者獲得的有效部位活性更高。KPC-rg1不但可用于各類皰疹病毒感染外用治療性藥物的開發，還有望用于包膜類病毒滅活疫苗的制備[5-6]。

KPC-rg1的化學結構目前尚不清晰。我們認為KPC-rg1是一類水溶性的酚性色素，由多酚及糖類物質經氧化聚合反應而形成，是一類結構復雜的異質的酚性化合物的總稱。KPC-rg1兼有鞣質和糖類的部分理化性質[5]。目前尚無法從中分得單體化合物并鑒定結構。為逐步揭示其化學本質，并尋求其質量控制手段，我們進行了多方面的研究。采用中紅外光譜技術結合化學計量學研究其指紋圖譜，基于整體性和模糊性表征其宏觀化學信息[7]。采用磷鉬鎢酸-干酪素法測定其中鞣質和酚性成分的含量[8]。本文從糖化學的角度，采用硫酸-苯酚比色法建立KPC-rg1總糖的含量測定方法。進而采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化法對KPC-rg1進行單糖組成分析，明確其單糖種類和組成比例，并獲得特征圖譜。本研究為KPC-rg1的進一步研究、開發和綜合利用提供技術手段并奠定實驗基礎，以期形成具有我國自主知識產權的中藥、天然創新藥物，為中藥復雜體系有效部位新藥開發提供參考。

1 儀器、材料與試劑

1.1 儀器

安捷倫1260高效液相色譜儀(包括在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、DAD檢測器)(美國Agilent公司)；UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津公司)；5510E-DTH超聲儀(美國必能信公司)；Milli-Q超純水機(Millipore公司)；CP225D電子分析天平(賽多利斯公司)。

1.2 材料與試劑

肉桂抗病毒有效部位(KPC-rg1)(批號：20150626，20151201，20160425)由昆藥集團股份有限公司提供，制備工藝同文獻[5-7]。阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸對照品購自Alfa Aesar公司。鼠李糖對照品購自TCI公司。艾杜糖醛酸對照品購自Carbosynth公司。巖藻糖、半乳糖醛酸對照品及1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)購自Sigma-Aldrich公司。乙腈為色譜純，購自德國默克股份兩合公司。水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 苯酚-硫酸分光光度法測定總糖含量

2.1.1 溶液制備 苯酚溶液：精密稱取苯酚適量，加水配成濃度為5%的溶液，即得，置于冰箱中備用(現用現配)。葡萄糖對照品溶液：精密稱取葡萄糖對照品適量，加水配成每1 mL含0.10 mg的溶液，即得。供試品溶液：精密稱取KPC-rg1適量，加水配成每1 mL含0.28 mg的溶液，即得。

2.1.2 檢測波長選擇 精密吸取供試品和葡萄糖對照品溶液各1 mL，分別置于20 mL具塞刻度試管中，分別精密加入1 mL水，1 mL 5%苯酚溶液，室溫下快速精密加入5 mL濃硫酸，冷卻10 min，混勻后放置20 min。另取1 mL水同上操作制得空白溶液。紫外-可見分光光度計于波長400～600 nm范圍進行掃描。供試品溶液和對照品溶液均在490 nm波長處有最大吸收，且無其它干擾峰影響分析，故選擇490 nm作為檢測波長。

2.1.3 標準曲線繪制 精密吸取葡萄糖對照品溶液0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1 mL、1.2 mL、1.4 mL，分別置于20 mL具塞刻度試管中，精密加水至2.0 mL，精密加入1 mL 5%苯酚溶液，室溫下快速精密加入5 mL濃硫酸，冷卻10 min，混勻后放置20 min。另取相應體積的水同上操作制得相應的空白溶液。紫外-可見分光光度計于490 nm波長處下測定吸光度，每份測兩次，計算平均值。以葡萄糖濃度為橫坐標X，吸光度為縱坐標Y繪制標準曲線，得回歸方程Y=53.059X-0.021 2，r=0.999 8。結果表明在0.005 0～0.017 5 mg·mL-1范圍內，濃度與吸光度呈良好的線性關系。

2.1.4 精密度試驗 精密吸取對照品溶液1 mL置于20 mL具塞刻度試管中，按“2.1.3標準曲線繪制”項下的方法，自“精密加水至2.0 mL”起，依法操作并測定吸光度，連續測6次，RSD為0.15%，結果表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復性試驗 取同一批號樣品，按“2.1.1”項下的方法平行制備6份供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液1 mL置于20 mL具塞刻度試管中，按“2.1.3標準曲線繪制”項下的方法，自“精密加水至2.0 mL”起，依法操作并測定吸光度，RSD為0.98%，結果表明方法重復性良好。

2.1.6 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液1 mL置于20 mL具塞刻度試管中，按“2.1.3標準曲線繪制”項下的方法，自“精密加水至2.0 mL”起，依法操作，于0、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min測定吸光度，吸光度RSD為1.53%，結果表明溶液于60 min內穩定性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗 分別精密稱取已知含量的同一批號樣品9份，每份14 mg，分別置于100 mL容量瓶中。分3組，每組3份，各分別加入50%、100%和150%的葡萄糖對照品，加水定容至刻度，搖勻，制得9份加樣回收供試品溶液。分別精密吸取加樣回收供試品溶液1 mL置于20 mL具塞刻度試管中，按“2.1.3標準曲線繪制”項下的方法，自“精密加水至2.0 mL”起，依法測定，計算加樣回收率，平均回收率為99.25%，RSD為1.45%。結果表明本方法加樣回收率良好。

2.1.8 樣品含量測定 取3批樣品，按“2.1.1”項下的方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液1 mL置于20 mL具塞刻度試管中，按“2.1.3標準曲線繪制”項下的方法，自“精密加水至2.0 mL”起，依法測定，根據標準曲線計算各批次樣品中的總糖含量，批號20150626、20151201、20160425樣品的總糖含量分別為36.12%、39.23%和41.66%，平均值為39.00%。

2.2 PMP柱前衍生化法分析單糖組成

2.2.1 溶液制備 單糖對照品溶液：分別精密稱取各單糖對照品適量，加水配成每1 mL含1.0 mg的溶液，使用時按需要以水稀釋或混合配成單標或混合對照品溶液。

KPC-rg1樣品酸水解及PMP衍生化：精密稱取KPC-rg1適量，加水配成每1 mL含2.0 mg的溶液。精密量取該溶液300μL至5 mL具塞試管中，加入4 mol·L-1三氟乙酸300μL，充N2，封管，110 ℃水解4 h。水解液置70 μC水浴鍋中蒸干，蒸干過程中加入甲醇適量以除去水解液中的三氟乙酸。蒸干后的樣品加水50μL溶解，加入0.6 mol·L-1NaOH溶液50μL和0.5 mol·L-1PMP甲醇溶液100μL，渦旋混勻。置70 ℃烘箱反應60 min，取出室溫放置10 min，加入0.3 mol·L-1HCl 100μL中和，加入三氯甲烷500 μL萃取3次，小心棄去氯仿層，上清液加水定容至1 mL。

單糖對照品的PMP衍生化：精密量取標準單糖對照品溶液50μL，不進行酸水解，PMP衍生化方法與樣品一致，自“加入0.6 mol·L-1NaOH溶液50μL和0.5 mol·L-1PMP甲醇溶液100μL”開始如法操作。

2.2.2 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5μm)；以0.1 mol·L-1乙酸銨(pH=5.5)緩沖液-乙腈(85∶15)為流動相進行等度洗脫；流速1 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長250 nm；進樣量20μL。該色譜條件下，單糖混合對照品和樣品PMP衍生物的HPLC見圖1。

注：1：PMP；2：甘露糖；3：鼠李糖；4：葡萄糖醛酸；5：艾杜糖醛酸；6：半乳糖醛酸；7：葡萄糖；8：半乳糖；9：阿拉伯糖；10：巖藻糖。圖1 樣品PMP衍生物(A)和單糖混合對照品(B)的HPLC圖

2.2.3 線性關系考察 對照圖1單糖混合對照品和樣品PMP衍生物色譜圖中主要色譜峰的保留時間，確定KPC-rg1中的單糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖5種單糖組成。故針對該5種單糖進行方法學考察。

分別取甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖對照品溶液，按“2.2.1”項下的規定衍生化，以水逐級稀釋成一系列不同濃度的工作液，按“2.2.2”項下的規定進樣分析，以濃度為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y繪制工作曲線，計算回歸方程。結果見表1，各單糖在相應的質量濃度范圍內線性關系良好。

表1 5種單糖的線性關系

2.2.4 精密度試驗 取KPC-rg1樣品，按“2.2.1”項下的規定衍生化，按“2.2.2”項下的規定連續進樣6次，記錄峰面積。甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的峰面積RSD為0.21%～0.55%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復性試驗 取同一批號KPC-rg1樣品，按“2.2.1”項下的規定平行制備6份衍生化樣品，按“2.2.2”項下的規定進樣分析，記錄峰面積。甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的峰面積RSD為0.87～1.93%，表明方法重復性良好。

2.2.6 穩定性試驗 取KPC-rg1樣品，按“2.2.1”項下的規定衍生化，分別于0、2、4、6、8、12 h按“2.2.2”項下的規定進樣分析，記錄峰面積。甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的峰面積RSD為0.90%～1.89%，表明樣品于12 h內穩定。

2.2.7 加樣回收率試驗 分別精密稱取已知含量的同一批號樣品6份，每份25 mg，分別置于25 mL容量瓶中，各分別加入100%的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖對照品，加水定容至刻度，搖勻，制得6份加樣回收供試品溶液。分別按“2.2.1”項下的規定衍生化，按“2.2.2”項下的規定進樣分析，計算加樣回收率，甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的平均回收率為96.04%～101.35%，RSD為1.42%～1.97%，表明方法加樣回收率良好。

2.2.8 樣品單糖組成分析 取KPC-rg1樣品，按“2.2.1”項下的規定衍生化，按“2.2.2”項下的規定進樣分析，根據標準曲線計算各組成單糖含量。根據公式n=m/M(n為單糖摩爾數，m為單糖質量，M為單糖摩爾質量)，計算各組成單糖的摩爾比例，甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖比例為0.14∶0.28∶0.38∶1∶0.92。

3 討論

KPC-rg1優秀的抗病毒活性和廣闊的應用前景推動我們對其進行持續的研究開發。物質基礎不明確是制約其成藥性的關鍵問題。本課題組前期曾采用多種分離手段(包括硅膠、十八烷基鍵合硅膠、Sephadex LH-20等)嘗試對KPC-rg1進行分離，但均未能獲得單體化合物。隨著研究的逐漸深入，我們認為KPC-rg1是一類水溶性、分子量不均一、復雜的天然多聚物，具有酚類和糖類的結構片段，經氧化、聚合、耦合等作用形成。類似的化合物在自然界廣泛存在，較為著名的如茶褐素。茶褐素是普洱茶等黑茶中含有的水溶性高聚色素，顏色為棕褐色或棕紅色，在普洱干茶中的含量可達12%，是構成黑茶品質特征的重要物質基礎[9-10]。但由于結構的復雜性，有關其分離純化及結構鑒定的研究至今仍處于探索中。該類復雜天然產物的結構特點為其質量控制提出了嚴峻的挑戰。為此我們嘗試針對其物理化學特征，從多個角度對其進行多維的表征。本研究針對其糖類結構片段進行了探索性研究。

苯酚-硫酸比色法是總糖含量測定的經典方法，該方法具有顯色穩定、靈敏度較高、受其他碳水化合物和蛋白質干擾較小等優勢，在中藥、天然藥物領域應用范圍較為廣泛[11-13]。本研究在方法建立過程中，針對KPC-rg1的特點對實驗參數進行了細致的調整與優化，包括：苯酚濃度、苯酚用量、濃硫酸用量、濃硫酸加入方式、顯色溫度和時間等，從而確定了最適合的實驗條件。本研究以葡糖糖為對照品對樣品總糖含量進行測定。以葡糖糖計，3批KPC-rg1總糖含量的平均值為39.00%。作為測量值，因未考慮各個單糖的校正因子，該含量并非樣品中糖類物質的真實含量，但可作為含量指標初步評價產品質量和一致性。

單糖組成分析是糖類結構表征和解析的重要手段。因糖大多沒有發色團，單糖結構相近且極性較強，難以滿足高靈敏度分析手段的檢測要求。PMP衍生化方法可使糖類在245 nm處產生強烈的紫外吸收，條件較溫和，無需酸催化劑，且產物無唾液酸異構，是較理想的衍生化方法[14，15]。本研究采用HPLC對PMP衍生產物進行分析檢測，明確單糖種類和組成比例，并獲得特征圖譜。該方法在苯酚-硫酸比色法測定總糖含量的基礎上，為KPC-rg1的質量評價和控制提供了更為精準的技術手段，并從糖化學的角度對KPC-rg1的物質基礎進行了探索。

4 結論

本研究建立了肉桂抗病毒有效部位KPC-rg1總糖測定及單糖組成分析方法。實驗結果表明該方法簡便、快速、準確、可靠，可用于KPC-rg1的質量控制，為其進一步研究、開發和綜合利用提供技術手段并奠定實驗基礎，為中藥復雜體系有效部位新藥開發提供了參考。