續斷鑒別及川續斷皂苷VI的含量測定

艾光麗，艾青青，高 鵬

(成都市食品藥品檢驗研究院/國家藥品監督管理局中藥材質量監測評價重點實驗室，四川 成都 610045)

續斷為川續斷科植物川續斷DipsacusasperWall.ex Henry的干燥根，具有補肝腎、強筋骨、續折傷、止崩漏的功效[1]。現代研究表明，續斷主要含有三萜皂苷、環烯醚萜苷、生物堿等成分[2-4]，其中三萜皂苷類成分川續斷皂苷Ⅵ為主要活性成分，具有促進骨髓間質干細胞增殖和向成骨細胞分化以及促進骨傷愈合、抗骨質疏松的作用[5-7]。續斷主產于湖北、湖南、重慶、四川、貴州等省市[2-3]。《中國藥典》2020版第一部“續斷鑒別及含量測定”項下方法較為復雜，故本研究對其薄層鑒別及含量測定進行了改進，報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Waters2695-2998高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Agilent 1200高效液相色譜儀(德國安捷倫科技有限公司)；Thermo UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；CAMAG自動點樣器；ME204E電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；SK250H超聲波清洗器；默克(Merck)HPTLC高效薄層層析板等。

對照品：川續斷皂苷VI(111685-201908，含量為94.3%)；續斷對照藥材(121033-201812)；均由中國食品藥品檢定研究院提供。

樣品：續斷樣品32批，其中四川23批、貴州2批、云南7批。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備 取續斷粉末0.1 g，加20 mL甲醇，超聲處理20 min，作為供試品溶液。

2.1.2 對照藥材溶液的制備 取續斷對照藥材0.1 g，加20 mL甲醇，超聲處理20 min，作為對照藥材溶液。

2.1.3 對照品溶液的制備 取川續斷皂苷VI對照品，加甲醇制成每 1 mL約含 0.2 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.4 點樣量 吸取續斷對照藥材溶液、續斷供試品溶液、川續斷皂苷VI對照品溶液各 10 μL，分別點于同一高效硅膠G薄層板上。

2.1.5 展開系統的篩選 (1)藥典方法：參照2020年版《中國藥典》一部“續斷”項下鑒別(2)的方法，發現此方法顯色不明顯且處理方法較繁瑣，故對其進行了改進。薄層色譜，見圖1。

吳參謀沒有跑，他讓手下弟兄迅速搶占有利地形，阻擊四周云集的鬼子，他深知自己擋不了鬼子多久，但只要多擋一分鐘，孔老一他們就多一分活著逃脫的希望。

注：1.川續斷皂苷VI；2.續斷對照藥材；3.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖1 藥典方法薄層色譜

(2)選定方法：將續斷對照藥材溶液、續斷供試品溶液、川續斷皂苷VI對照品溶液分別點于同一高效硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水(14∶7∶2)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加熱至斑點顯色清晰，分別置日光和紫外光燈(365 nm)下檢視。發現此方法下供試品與對照藥材相對應的斑點更多，顏色更清晰，分離效果更好，操作更簡便，且Rf值適中，故認為運用此方法分離續斷中的有效成分較為適宜。薄層色譜，見圖2、圖3。

注：1.川續斷皂苷VI；2.續斷對照藥材；3.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖2 選定方法薄層色譜日光圖

注：1.川續斷皂苷VI；2.續斷對照藥材；3.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖3 選定方法薄層色譜紫外圖

(3)其他薄層色譜展開條件篩選：方法①：將續斷對照藥材溶液、續斷供試品溶液、川續斷皂苷VI對照品溶液分別點于同一高效硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水(14∶6∶2)的下層溶液為展開劑，此方法薄層色譜中供試品與對照藥材相對應的斑點多，顏色清晰，分離效果好，但川續斷皂苷VI的Rf值較低，故該展開系統不適合用于續斷定性鑒別。薄層色譜，見圖4、圖5。

注：1.川續斷皂苷VI；2.續斷對照藥材；3.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖4 方法①薄層色譜日光圖

注：1.川續斷皂苷VI；2.續斷對照藥材；3.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖5 方法①薄層色譜紫外圖

方法②：將續斷對照藥材溶液、續斷供試品溶液、川續斷皂苷VI對照品溶液分別點于同一高效硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)[8]的下層溶液為展開劑，此方法薄層色譜中供試品與對照藥材相對應的斑點多，顏色清晰，分離效果好，但川續斷皂苷VI的Rf值較低，故該展開系統不適合用于續斷定性鑒別。薄層色譜，見圖6、圖7。

注：1.川續斷皂苷VI；2.續斷對照藥材；3.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖6 方法②薄層色譜日光圖

注：1.川續斷皂苷VI；2.續斷對照藥材；3.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖7 方法②薄層色譜紫外圖

方法③：將續斷對照藥材溶液、續斷供試品溶液、川續斷皂苷VI對照品溶液分別點于同一高效硅膠G薄層板上，正丁醇-乙酸-水(4∶1∶5)[9]的上層溶液為展開劑，此方法薄層色譜中供試品與對照藥材相對應的斑點顏色清晰，Rf值適中，但川續斷皂苷VI的分離效果差，故該展開系統不適合用于續斷定性鑒別。薄層色譜，見圖8、圖9。

注：1.川續斷皂苷VI；2.續斷對照藥材；4.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖8 方法③薄層色譜日光圖

注：1.川續斷皂苷VI；2.續斷對照藥材；3.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖9 方法③薄層色譜紫外圖

方法④：將續斷對照藥材溶液、續斷供試品溶液、川續斷皂苷VI對照品溶液分別點于同一高效硅膠G薄層板上，正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)[10]的上層溶液為展開劑，此方法薄層色譜中供試品與對照藥材相對應的斑點顏色清晰，Rf值適中，但川續斷皂苷VI的分離效果差，故該展開系統不適合用于續斷定性鑒別。薄層色譜，見圖10、圖11。

注：1.川續斷皂苷VI；2.續斷對照藥材；4.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖10 方法④薄層色譜日光圖

注：1.川續斷皂苷VI；2.續斷對照藥材；3.CD-1；4.CD-2；5.CD-3；6.CD-4；7.CD-5；8.CD-6；9.CD-7；10.CD-8；11.CD-9；12.CD-10。圖11 方法④薄層色譜紫外圖

2.2 川續斷皂苷VI的含量測定

2.2.1 色譜條件 以C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱；以乙腈∶水(30∶70)為流動相；體積流量為1 mL/min；檢測波長212 nm，柱溫35 ℃，進樣量 10 μL。在上述色譜條件下，川續斷皂苷VI與其他色譜峰分離較好，分離度>1.5，且空白溶劑無干擾。見圖12。

注：A.對照品；B.樣品；C.空白溶劑；1.熊果酸。圖12 川續斷皂苷VI專屬性色譜圖

2.2.2 對照品溶液的制備 取川續斷皂苷VI對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品細粉0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 線性關系與標準曲線 精密稱取川續斷皂苷VI對照品7.915 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液。精密吸取上述溶液各0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。測定結果顯示川續斷皂苷VI進樣濃度在7.463 8～44.783 1 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系；回歸方程：y=3446.113 5x-4 860.733 3；相關系數R2=0.999 9。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取川續斷皂苷VI對照品溶液10 μL(0.182 2 mg·mL-1)，注入液相色譜儀中，連續進樣6次，測得其峰面積并計算川續斷皂苷VI峰面積的RSD<3.0%，結果表明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL(批號CD-3)，分別在0、6、10、12、14、16、20、24 h依次進樣，測定其峰面積并計算，川續斷皂苷VI峰面積的RSD<3.0%，結果表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗 精密稱取同一批樣品6份(批號CD-3)，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣10 μL依法測定峰面積并計算，川續斷皂苷VI含量的RSD為<3.0%，表明該方法重復性較好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品(CD-2)9份，每份0.25 g，精密稱定，分成3組，每組3份，3組分別加入川續斷皂苷VI對照品溶液(濃度為4.640 7 mg/mL)0.5 mL，1 mL，1.5 mL。按擬定的方法制成供試品溶液，計算9份供試品的加樣回收率。結果顯示，川續斷皂苷VI的加樣回收率為101.37%～102.68%，RSD為0.45%，<3.0%，表明該方法準確度良好。見表1。

表1 川續斷皂苷VI加樣回收率試驗結果

2.2.9 樣品含量測定 取收集的32批續斷樣品，按選定方法測定川續斷皂苷VI的含量。見表2。

表2 32批續斷樣品含量測定結果

3 討論

續斷有效成分主要是皂苷或苷類成分，易溶于甲醇，故選擇甲醇作為提取溶劑。三氯甲烷、二氯甲烷對皂苷類成分分離效果較好，故選擇毒性相對較小的二氯甲烷作為展開劑的主要試劑。

取川續斷皂苷VI對照品溶液，在波長 200～400 nm 范圍內進行紫外光譜掃描，并記錄光譜圖。結果顯示其在近紫外端下具有較強吸收，參照2020年版《中國藥典》一部[1]“續斷含量”項下，故本研究選用 212 nm 作為檢測波長。

依據相關文獻方法[1，11-13]，本實驗比較了乙腈-水(30∶70)、甲醇-0.1%鹽酸溶液(68∶32)、乙腈-0.05%甲酸溶液(30∶70)、乙腈-0.1%磷酸溶液(30∶70)四種流動相，結果以乙腈-水(30∶70)為流動相，基線平穩，色譜峰峰形對稱，操作簡便。

本實驗對提取溶劑(50%甲醇、70%甲醇、甲醇、乙醇)、超聲時間(20、30、40 min)、回流(30、40、60 min)等進行研究，在考察了分離度、色譜峰形以及過濾速度后，最終確定了甲醇超聲20 min作為供試品溶液的制備方法。

本實驗所建立的續斷薄層鑒別方法及川續斷皂苷VI的含量測定方法，方法簡便，專屬性強，耐用性好，能夠為續斷的質量控制和進一步開發利用提供實驗依據。