Ambra1介導自噬對肝癌細胞增殖和凋亡的影響

王連濤，甘云輝，李應軍，溫華生

（深圳市中西醫結合醫院胃腸外科，廣東深圳 518104）

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤[1]。研究表明，自噬參與多種腫瘤的發生及發展，如結直腸癌、舌癌、宮頸癌。自噬是細胞中一個極其精細的過程，由自噬相關基因ATG（autophagy-related genes）調控，目前已有超過34個自噬相關基因從酵母中分離出來[2]。Ambra1可以調節自噬過程的發生和發展，其可促進或抑制腫瘤的發生發展[3]。Ambra1具有促腫瘤作用，其介導的自噬可保護腫瘤細胞；同時Ambra1還可能通過調節其他信號通路發揮抗腫瘤作用。目前該因子在肝癌方面的研究報道很少。本研究通過選取肝癌細胞HepG2做為本研究細胞系并構建shRNA慢病毒，從而探究Ambra1介導自噬對肝癌細胞增殖和凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 重組慢病毒載體的構建 Bam HI和Eco RI雙酶切目的基因分別回收shAmbra1組和shAmbra1+3-MA基因片段，再分別克隆于經Bam HI和Eco RI雙酶切的慢病毒p PLK/GFP/+Puro載體。

1.2 細胞分組與處理 shNon組：細胞分別以相應慢病毒載體感染shAmbra1組和shAmbra1+3-MA基因片段后，在無氨基酸無血清的EBSS培養液中培養8~12 h；shAmbra1組：細胞分別以相應慢病毒載體感染sh Ambra1+3-MA基因片段后，在無氨基酸無血清的EBSS培養液中培養8~12 h；sh Ambra1+3-MA組：細胞在用無氨基酸無血清的EBSS培養液培養前1 h加入3-MA（10 mmol/L），于倒置顯微鏡下觀察細胞形態的改變。

1.3 觀察指標

1.3.1 細胞自噬的檢測 通過Western blotting法檢測細胞自噬蛋白，包括微管相關蛋白1輕鏈3-I（LC3-I）、微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、酵母ATG6同源物（Beclin-1）和自噬相關基因5（ATG5）表達。

1.3.2 MTS法 檢 測 細 胞 增 殖 能 力 shNon組、sh Ambra1組 和shAmbra1+3-MA組 細 胞 感 染72 h后，在無氨基酸無血清的EBSS培養液中培養8~12 h，分別用0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM培養液配成單個細胞懸液。連續觀察5 d，計算細胞增殖率。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 shNon組、sh Ambra1組和shAmbra1+3-MA組細胞感染72 h后，在EBSS培養液中培養12 h，采用AnnexinV/FITC檢測試劑盒檢測細胞凋亡水平。

1.4 統計學方法 本研究中數據全部采用SPSS 20.0統計分析軟件進行處理；計量資料采用“均數±標準差”（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析、重復測量的方差分析以及析因設計方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2分析；P＜0.05代表差異存在統計學意義。

2 結果

2.1 不同組別細胞自噬相關蛋白表達 shNon組細 胞 自 噬 相 關 蛋 白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1和ATG5表達高于shAmbra1組和shAmbra1+3-MA組，而shAmbra1組細胞自噬相關蛋白表達高于shAmbra1+3-MA組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同組別細胞自噬相關蛋白表達

2.2 不同組別細胞增殖能力 隨著培養時間延長，3組細胞的增殖能力降低，且shNon組細胞增殖能力高于shAmbra1組 和shAmbra1+3-MA組，而shAmbra1組細胞增殖能力高于shAmbra1+3-MA組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 不同組別細胞增殖能力

2.3 不同組別細胞凋亡能力 隨著培養時間延長，3組細胞的凋亡能力均增大，且shNon組凋亡率小于shAmbra1組 和shAmbra1+3-MA組，而shAmbra1組細凋亡率小于shAmbra1+3-MA組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 不同組別細胞凋亡能力

3 討論

近年來，有研究學者對酵母和哺乳動物細胞中參與自噬調控的一系列基因進行了研究，結果發現，在肝癌細胞中Ambra1能夠促進自噬過程的發生發展，同時還可以抑制腫瘤細胞凋亡的發生[5]。本研究表明，細胞凋亡能力變化趨勢則與增殖能力變化趨勢相反。

自噬是細胞處于生長環境惡劣或者缺乏營養時采取的一種自我保護方式，此時細胞主要是通過分解自己內部的營養成分并反復循環再利用來維持生存。自噬過程的發生主要針對的是細胞內底物，包括細胞器以及一些性質特殊的蛋白復合物，最終被溶酶體降解，發生再循環。近年來，研究學者對酵母和哺乳動物細胞中參與自噬調控的一系列基因進行了研究，結果發現[5]，在肝癌細胞中Ambra1能夠促進自噬過程的發生發展，同時還可以抑制腫瘤細胞凋亡的發生。

肝癌細胞HepG2在凋亡誘導劑的刺激下表現出了Ambra1的降解，這種Ambra1的降解效應表明Ambra1在肝癌細胞中可能發揮著抑制凋亡的作用。并且，LC3-I、LC3-Ⅱ、Beclin-1和ATG5的激活與細胞凋亡存在密切的相關性，表明Ambra1降解的原因可能與微管相關蛋白或自噬相關蛋白有關，并且通過本次研究也進一步確認了Ambra1介導自噬對肝癌細胞增殖和凋亡的影響與上述蛋白的共同作用有關。筆者分析認為Ambra1作為腫瘤抑制因子參與了腫瘤的發生和發展[6]。Ambra1可能通過調控上皮間質轉化（EMT）和細胞外信號調節激酶（ERK）信號通路促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲[7-9]。目前對于Ambra1抑制腫瘤的機制，認為Ambra1聯合自噬適配體LC3對是否有E3連接酶PARKIN的線粒體清除都非常重要，即Ambra1可以通過介導線粒體自噬抑制腫瘤[10-12]。

綜上所述，在肝癌細胞HepG2中，腫瘤細胞通過自噬抵抗外部環境給予的壓力，Ambra1在正性調控自噬的同時負性調控凋亡。因此，Ambra1在肝癌中調節細胞增殖和凋亡的機制可能會為肝癌的進一步治療提供相應的理論基礎和研究策略。