加米霉素注射液細菌內毒素檢查（凝膠法）方法學研究

于小婷，張漫，鄢明華，王俊菊，姜淋潔，王猛，程雪嬌

摘要：參照《中華人民共和國獸藥典》2015版一部附錄1143細菌內毒素檢查法的有關規(guī)定，對加米霉素注射液內毒素限度及檢查方法進行了研究。結果顯示，加米霉素注射液通過調節(jié)pH并將供試品稀釋到498倍及以上時，對細菌內毒素檢查無干擾，內毒素限值確定為0.83EU/mg。對3批產品進行檢查，結果均符合規(guī)定。因此，細菌內毒素檢查方法（凝膠法）可用于加米霉素注射液的細菌內毒素檢查。

關鍵詞：加米霉素注射液;內毒素檢查;凝膠法

加米霉素[1，2]屬大環(huán)內酯類抗生素，是由法國梅里亞公司研發(fā)的第二代大環(huán)內酯類抗生素的代表藥物之一，在獸醫(yī)臨床具有廣闊的應用前景。細菌內毒素是革蘭氏陰性菌的細胞壁成分，可引起人和動物發(fā)熱[3，4]。藥品如果被細菌內毒素污染會產生嚴重的安全問題，尤其是對身體機能較差的患病及幼齡動物。目前國內已有數家獸藥企業(yè)進行了加米霉素注射液的研發(fā)和新獸藥申報，但不同廠家研發(fā)的加米霉素注射液處方、工藝不盡相同，這也決定了企業(yè)需根據自身產品的特點，建立相應的內毒素檢查方法學。為保證加米霉素注射劑在使用過程中的安全性，本研究對加米霉素注射液細菌內毒素檢查的可行性進行了方法學驗證，為該產品細菌內毒素的檢查提供依據。

1 試驗材料

1.1 儀器

單人凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司;

101型電熱鼓風干燥箱，北京中興偉業(yè)世紀儀器有限公司;

QL-861型旋渦混合器，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司;

DZKW-4恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司;

試驗所用玻璃器皿經250℃烘烤1h以上。

1.2 藥品與試劑

細菌內毒素工作標準品（批號：150601-201784，規(guī)格：80EU/支，中國食品藥品檢定研究院）細菌內毒素檢查用水（批號：1807130，規(guī)格：5mL/支，湛江安度斯生物有限公司）鱟試劑（TAL）（批號：1706022，靈敏度：0.25EU/mL，規(guī)格：0.1mL/支，湛江安度斯生物有限公司）鱟試劑（TAL）（批號：1704203，靈敏度：0.25EU/mL，規(guī)格：0.1mL/支，湛江博康海洋生物有限公司）Tris緩沖液（批號：1808240，規(guī)格：4mL/支，湛江安度斯生物有限公司）加米霉素注射液（批號：201801001，201801002，201801003，

202001001，202001002，202001003規(guī)格：150mg/mL，天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核試驗

根據《中華人民共和國獸藥典》2015版附錄1143“細菌內毒素檢查法”[5]，進行鱟試劑的標示靈敏度復核。結果見表1。結果顯示2種不同廠家的鱟試劑的復核靈敏度λc均在0.5～2.0λ之間，符合規(guī)定。

2.2 細菌內毒素限值（L）的確定

根據公式：L=K/M[6]，式中，M為每千克體重每小時最大劑量，本藥品的推薦劑量為6mg/kg·bw，一個療程僅用1次，確定M為6mg/（kg·h）;K為注射劑的致熱閾值K=5EU/（kg·h），則L=5EU/（kg·h）/6mg/（kg·h）=0.83EU/mg。為保障安全用藥，故將加米霉素注射液的內毒素限值確定為0.83EU/mg。

2.3 加米霉素注射液最大有效稀釋倍數（MVD）的確定

根據公式MVD=L×C/λ，其中L為加米霉素注射液的細菌內毒素限值0.83EU/mg，濃度C為150mg/mL，λ為鱟試劑標示靈敏度，目前市售鱟試劑靈敏度λ通常在0.5～0.03EU/mL。則加米霉素注射液的對應最大有效稀釋倍數為：MVD 0.5～MVD 0.03分別為249、498、996、1，992和3，984倍。

2.4 干擾試驗預實驗

由于處方中含有一定濃度的丁二酸，經測制劑pH為5.0左右，一般供試品溶液和鱟試劑混合后溶液的pH值在6.0～8.0之間為宜，因此加米霉素注射液在稀釋過程中加入內毒素檢查專用Tris緩沖液，使其稀釋液pH維持在7.0左右。

取加米霉素注射液，用細菌內毒素檢查用水進行稀釋，在稀釋過程中加入Tris緩沖液，并最終稀釋至249、498、996、1，992和3，984倍，依法檢測，結見表2。預試驗結果顯示供試品稀釋到498倍及以上稀釋倍數時，供試品溶液對鱟試劑反應無干擾，根據上述結果初步選定供試品有效稀釋倍數為498倍。

2.5 正式干擾試驗

現依法進行正式干擾試驗。取3批加米霉素注射液，用細菌內毒素檢查用水將供試品進行498倍的稀釋（NPC），依法檢測，結果見表2。結果顯示3批依法添加內毒素的供試品溶液的反應結果均在0.5～2.0λ之間，依據《中華人民共和國獸藥典》2015版附錄1143細菌內毒素檢查法的要求，認為供試品在該濃度下無干擾作用。

樣品細菌內毒素檢查。取加米霉素注射液3批，用內毒素檢查用水將樣品稀釋成498倍的供試品溶液（NPC），在稀釋的過程中加入Tris緩沖液調節(jié)pH，依法檢測，結果見表4。結果表明3個批次的498倍稀釋的供試品溶液的內毒素含量均小于0.25EU/mL，說明3批加米霉素注射液樣品的內毒素含量低于0.83EU/mg，符合要求。

3 討論

在預干擾試驗期間，發(fā)現陽性供試品溶液（PPC）經常出現無規(guī)律的陰性結果，而陽性對照和陰性對照結果均正常，說明試驗材料、操作及環(huán)境均正常。經過一系列因素排查，推測是供試品溶液pH引起的問題。由于處方中含有一定濃度的丁二酸，498倍稀釋液pH為5.6左右，一般供試品溶液和鱟試劑混合后溶液的pH值在6.0～8.0之間為宜，因此在樣品稀釋過程中加入Tris緩沖液，使供試品溶液pH維持在7.0左右，再進行預干擾試驗，PPC便沒有再發(fā)生不凝集的現象。

本試驗用兩個廠家的鱟試劑對加米霉素注射液共3個批次的樣品進行了干擾試驗，結果表明：樣品在稀釋的過程中加入pH 7.2的Tris緩沖液調節(jié)pH，并最終稀釋至498倍（濃度為0.3mg/mL）的供試品溶液對細菌內毒素和鱟試劑反應無干擾，確定所采用的方法可行。加米霉素注射液可適用細菌內毒素檢查法，用靈敏度為0.25EU/mL的鱟試劑按凝膠限度檢查法對3批產品進行細菌內毒素檢查，結果均符合規(guī)定。

4 結論

本研究建立了加米霉素注射液的細菌內毒素檢查法，試驗結果表明加米霉素注射液可適用細菌內毒素檢查法（凝膠法）;由于加米霉素注射液具有一定的酸性，在做細菌內毒素檢查時，會對鱟試劑產生一定的干擾作用，可以通過加入內毒素檢查專用Tris緩沖液解決這一問題。

本研究建立的細菌內毒素檢查法適用于天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司生產的加米霉素注射液，由于不同廠家的處方工藝不盡相同，內毒素檢查干擾因素也不相同，因此對于不同廠家生產的加米霉素注射液應根據實際情況建立與其適應的內毒素檢查方法，以便于更好的控制產品質量。

參考文獻：

[1] Menninger JR. Functional consequences of binding macrolidesto ribosomes[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy， 1985， 16（Suppl. A）：23-34.

[2] Zactran： EPAR-Scientific Discussion [EB/OL]. http：//www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_Scientific_Discussion/veterinary/000129/WC500068716.pdf.

[3] 陳新宇，曹春然，孫圓媛.枸櫞酸細菌內毒素檢查（凝膠法）方法學研究[J].中國藥品標準，2021，22（1）：61.

[4] 朗青.無菌原料藥頭孢噻肟鈉細菌內毒素的控制[J].煤炭與化工，2014，37（6）：41.

[5] 中華人民共和國獸藥典2015年版.一部[S].2015：200.

[6] 中華人民共和國藥典2015年版.四部[S].2015：154.