恩諾沙星注射液細菌內毒素檢查（凝膠法）方法學研究

康福忠，于小婷，王猛，楊雪，甄盼盼，程雪嬌

摘要：參照《中華人民共和國獸藥典》2015版一部附錄1143細菌內毒素檢查法的有關規定，對恩諾沙星注射液內毒素限度及檢查方法進行了研究。結果顯示，恩諾沙星注射液稀釋到800倍及以上時，對細菌內毒素檢查無干擾，內毒素限值確定為400EU/mL。對3批樣品進行檢查，結果均符合規定。本研究建立的細菌內毒素檢查方法（凝膠法）可用于恩諾沙星注射液的細菌內毒素檢查。

關鍵詞：恩諾沙星注射液;內毒素檢查;凝膠法

恩諾沙星屬氟喹諾酮類畜禽專用的廣譜殺菌藥。對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、支原體、衣原體等均有良好作用，在獸醫臨床上被廣泛應用。細菌內毒素是革蘭氏陰性菌的細胞壁成分，可引起人和動物發熱[1-3]。藥品如果被細菌內毒素污染會產生嚴重的安全問題，尤其是對身體機能較差的患病及幼齡動物。因此，控制恩諾沙星注射液中的細菌內毒素含量對于保證產品的安全性非常有必要。筆者對恩諾沙注射液的細菌內毒素檢查方法學進行了研究，為該產品細菌內毒素檢查提供依據。

1 試驗材料

1.1 儀器

單人凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司;

101型電熱鼓風干燥箱，北京中興偉業世紀儀器有限公司;

QL-861型旋渦混合器，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司;

DZKW-4恒溫水浴鍋，北京中興偉業儀器有限公司;

試驗所用玻璃器皿經250℃烘烤1h以上。

1.2 試驗藥品

細菌內毒素工作標準品，批號：201784，規格：80EU/支，中國食品藥品檢定研究院;

細菌內毒素檢查用水，批號：2010150，規格：5mL/支，湛江安度斯生物有限公司;

鱟試劑（TAL），批號：2008274，靈敏度：0.125EU/mL，規格：0.1mL/支，湛江安度斯生物有限公司;

鱟試劑（TAL），批號：2009213，靈敏度：0.125EU/mL，規格：0.1mL/支，湛江博康海洋生物有限公司;

恩諾沙星注射液，批號：20201001，20201002，20201003，規格：200mg/mL，天津市中升挑戰生物科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核試驗

根據《中華人民共和國獸藥典》2015版附錄1143“細菌內毒素檢查法”[4]，進行鱟試劑的標示靈敏度復核。結果見表1。結果顯示2種不同廠家的鱟試劑的復核靈敏度λc均在0.5～2.0λ之間，符合規定。

2.2 細菌內毒素限值（L）的確定

根據公式：L=K/M[5]，其中注射劑K=5EU/kg。M為每千克體重的最大供試品單次劑量，本藥品的推薦劑量為：一次量，每10kg體重，豬0.125mL，計算得出M為0.0125mL/kg，進一步計算得出L=400EU/mL，故將恩諾沙星注射液的內毒素限值確定為400EU/ml。

2.3 恩諾沙星注射液最大有效稀釋倍數（MVD）的確定

根據公式MVD=cL/λ，其中L為400EU/mL;c為供試品濃度1.0mL/mL（當L以EU/mpL表示時，則c=1.0mL/mL）;λ為鱟試劑標示靈敏度，根據市售鱟試劑現有規格，計算出恩諾沙星注射液MVD：MVD 0.5～MVD 0.03分別為800、1，600、3，200、6，400和12，800倍。

前期已進行干擾預實驗，供試品稀釋到800倍及以上稀釋倍數時，供試品溶液對鱟試劑反應無干擾。因此，參考現有鱟試劑的規格（λ=0.125EU/mL），MVD為3，200。

2.4 正式干擾試驗

現依法進行正式干擾試驗。取3批恩諾沙星注射液，用細菌內毒素檢查用水將供試品進行3，200倍的稀釋（NPC），依法檢測，結果見表2。結果顯示三批依法添加內毒素的供試品溶液的反應結果均在0.5～2.0λ之間，依據《中華人民共和國獸藥典》2015版附錄1143細菌內毒素檢查法的要求，認為供試品在該濃度下無干擾作用。

2.5 樣品細菌內毒素檢查

另取恩諾沙星注射液3批，依法進行內毒素檢測，結果見表3。結果表明3個批次的3，200倍稀釋的供試品溶液的內毒素含量均小于0.125EU/mL，說明三批恩諾沙星注射液的內毒素含量低于400EU/mL，符合要求。

3 討論

本試驗用兩個廠家的鱟試劑對恩諾沙星注射液三個批次的樣品進行了干擾試驗，結果表明樣品稀釋至3，200倍的供試品溶液對鱟試劑反應無干擾，確定所采用的方法可行。恩諾沙星注射液可適用細菌內毒素檢查法（凝膠法），用靈敏度為0.125EU/mL的鱟試劑按凝膠限度檢查法對另外3批樣品進行細菌內毒素檢查，結果均符合規定。

本研究建立的細菌內毒素檢查法適用于天津市中升挑戰生物科技有限公司生產的恩諾沙星注射液（20%），該產品為國家五類新獸藥，目前市場上未見其他廠家產品，由于不同廠家的處方工藝不盡相同，內毒素檢查干擾因素也不相同，因此，未來其他獸藥廠家生產的恩諾沙星注射液（20%）應根據實際情況建立與其適應的內毒素檢查方法，以便于更好地控制產品質量。

參考文獻：

[1] 朗青.無菌原料藥頭孢噻肟鈉細菌內毒素的控制[J].煤炭與化工，2014，37（6）：41.

[2] 張虞婷，丁蘇蘇，李倚云.細菌內毒素的研究進展及其檢查法的應用[J].天津藥學，2015，27（5）：66.

[3] 陳新宇，曹春然，孫圓媛.枸櫞酸細菌內毒素檢查（凝膠法）方法學研究[J].中國藥品標準，2021，22（1）：61.

[4] 中華人民共和國獸藥典：一部[S].2015年版.2015：200.

[5] 中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.2015：154.