沈陽地區豬源性奇異變形桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

王一，張妍妍

摘要：從沈陽某豬場分離得到一種革蘭氏陰性、無莢膜、無芽孢、短小桿菌，純化后經16S rRNA測序分析，初步確定分離菌為腸桿菌科變形桿菌屬，經培養特性觀察和生化試驗確定為奇異變形桿菌。將分離菌接種于小鼠，小鼠24h內死亡，證實該菌具有一定的致病性。在此基礎上進行藥物敏感性試驗，表明該菌對慶大霉素、環丙沙星較為敏感。本項研究結果為沈陽地區豬奇異變形桿菌病的診斷和治療提供了理論依據。

關鍵詞：豬;變形桿菌;分離鑒定;藥敏試驗

奇異變形桿菌（proteus mirabilis，PM）屬于腸桿菌科變形桿菌屬成員，變形桿菌屬包括普通變形桿菌、奇異變形桿菌、摩氏變形桿菌、雷氏變形桿菌和無恒變形桿菌五個種，其中奇異變形桿菌致病性較為嚴重，廣泛分布于泥土、水、糞便、以及人和動物的體表、黏膜及消化道，是一種常見的條件致病菌，其產生的毒素可引起中毒[1]。奇異變形桿菌能引起人和動物的尿道炎及腎盂腎炎，嚴重的能導致菌血癥、敗血癥[2]。Bisgaard M等在1981年從患有輸卵管炎蛋雞的輸卵管內分離出了奇異變形桿菌[3];江益民（1990）從有腹瀉和呼吸道癥狀的病死雞肝臟中分離出了奇異變形桿菌。葉樹株（1991）在福建發現并報道了豬的奇異變形桿菌病，這是國內首次對豬奇異變形桿菌的報道;隨后，徐春厚（1993）于黑龍江發現了該病，在之后的幾年里沒有豬奇異變形桿菌發病的報道，直至2008年變形桿菌的報道逐漸增多，四川、江蘇、福建、湖北、廣州[4～8]等地區也有報道。病豬以體溫升高，精神沉郁，腹瀉為主要臨床癥狀。剖檢可見病豬肺，肺門淋巴結、氣管、小腸等有明顯的病理變化[5]。

1材料與方法

1.1 材料

1）病料來源 沈陽某豬場2月齡仔豬發生體溫升高，精神不振，咳嗽、腹瀉、呼吸困難等癥狀，個別豬死亡，剖檢可見肺充血出血，呈紅色等，無菌采取肝臟3份，作為待檢病料。

2）主要試劑? 革蘭氏染液、營養瓊脂、麥康凱瓊脂按常規方法配置、生化反應管購于杭州濱和微生物試劑有限公司、DNA試劑盒杭州博日科技有限公司、2×Taq酶、慶大霉素、環丙沙星、四環素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那等11種藥敏試片物購自上海金穗生物科技有限公司。

3） 實驗動物? 選擇體重為18g～22g的昆明小白鼠，共20只，雌雄兼有。

1.2 方法

1）細菌的分離與純化 無菌條件下采取病豬的肝臟，分區劃線于普通營養瓊脂、麥康凱營養瓊脂平板，37℃培養18～24h，將疑似菌純化3代后觀察細菌形態。

2） 細菌染色鏡檢 采用革蘭氏染色對純化后分離菌進行染色鏡檢，鏡下觀察其形態基本一致判定為純化菌。

3） 16S rRNA擴增與測序 將分離菌接種于普通營養瓊脂上培養至對數期，使用DNA提取試劑盒提取總DNA，取5μL作為PCR模板。擴增引物參考William GW[9]設計的引物：27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，1492r：5'-TACGCYTACCTTGTTACGACTT-3'，預期產物大小約1500bp。反應體系：分離的細菌DNA模板5μL，2×Taq聚合酶15μL，引物上下游各1μL，ddH2O 8μL，共30μL;反應條件：預變性94℃5min，變性94℃1min，退火55℃0.5min，延伸72℃1min，共30個循環，最后72℃延伸10min，4℃保存。取PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓為120V，電流100mA，35分鐘后凝膠成像系統照相記錄結果。獲得預期產物后送至上海生物工程技術服務有限公司進行測序，采用Blast在線比對分析。

4） 培養特性觀察 將純化后的菌接種于麥康凱、伊紅美藍、鮮血瓊脂培養基25℃培養箱中培養24h觀察細菌落形態。

5） 生化鑒定 參照伯杰氏細菌鑒定手冊進行生化試驗[10]。將純化后的菌接種于13種生化微量反應管封口放于37℃培養箱中培養48h后，觀察。

6）藥敏試驗 采用紙片瓊脂擴散法測定該菌對常用抗生素的敏感性。測量所得抑菌圈直徑，參照CSLI的抗菌藥物敏感性試驗解釋標準[11]進行結果判定，敏感性判定標準（見表1）。

2 結果

2.1 病原分離與形態特征

在普通培養基上形成無色，半透明的扁平菌落，鏡下觀察細菌形態為革蘭氏陰性小桿菌，呈現多形性，但桿狀居多（見圖1）。

2.2 16S rRNA擴增與測序分析

分離菌純培養物利用16S rRNA通用引物27F、1492r進行PCR擴增，擴增出1500bp左右的特異性目的基因片段，與預期片段大小基本一致（如圖2）。測序后獲得有效序列1378bp，在NCBI數據庫中采用Blast在線比對分析，SFI分離菌的16s rRNA基因序列與變形桿菌序列的同源性很高，相似性在100%以上的有21株，且均為變形桿菌屬成員，由此可見分離菌為腸桿菌科變形桿菌屬成員。

2.3培養特性

在麥康凱培養基上形成圓形（37℃），扁平，圓形，半透明菌落。（見圖3）;在血瓊脂上呈灰白色平鋪并且有溶血現象;在伊紅美蘭瓊脂上不生長。在麥康凱上25℃培養時有明顯的遷徙性，呈波浪狀（圖4）。

2.4 生化鑒定結果

分離株蔗糖、木糖、枸櫞酸鹽、反應呈陽性;阿拉伯醇、赤蘚醇、肌醇、麥芽糖、甘露醇、鳥氨酸脫羧酶、衛矛醇、乳糖反應呈陰性;發酵葡萄糖產酸產氣;能產生H2S。參照伯杰氏細菌鑒定手冊，符合奇異變形桿菌的生化特性（見表2）。

2.5 藥敏試驗結果

根據試驗結果顯示該株奇異變形桿菌對慶大霉素、環丙沙星敏感，對頭孢喹肟為中敏，對鏈霉素、卡那霉素、紅霉素、四環素、妥布霉素、亞胺培南、氯霉素、萬古霉素耐藥（表3）。

2.6 致病性實驗

接種變形桿菌菌懸液后24h內，小鼠全部死亡。剖檢可見小鼠腹膜黃染，盲腸脹氣并伴有惡臭，肝臟腫脹脆弱易碎（圖5）。小鼠的心血接種均能分離到變形桿菌。對照組小鼠表現正常，無死亡。證明該菌對小鼠有致病性。

3討論

奇異變形桿菌在目前我國公布的細菌性食物中毒病原譜中排名第四，是引起食物中毒主要病原之一[12]。近些年關于豬變形桿菌病發病的報道越來越多，本實驗將臨床出現體溫升高，精神沉郁，腹瀉的病豬剖檢，獲得一株細菌，該菌在臨床癥狀，發病日齡，剖檢變化與沙門氏菌發病十分相似，后經16s rRNA送檢測序和生化實驗確定為豬的奇異變形桿菌，在此基礎上進行了致病性試驗，藥敏試驗，為臨床治療提供理論依據。

參考文獻：

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