基于PMA-mqPCR同時檢測阿膠制品中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌

◎ 梁濤波，龍 慧，王 丹，仉 薇，占忠旭，吳 鑫

（1.江西省食品檢驗檢測研究院，江西 南昌 330001；2.南昌市疾病預防控制中心，江西 南昌 330038）

阿膠是一種重要的藥食同源物質[1]，能用于中藥治療患者，也用于食品領域生產制造各種阿膠制品，如即食阿膠糕、阿膠紅糖茶等。有研究表明，阿膠用于食品生產在加工、運輸和儲存過程中容易受到微生物污染[2-3]，尤其是小作坊生產的產品其微生物安全應當予以重視[4]。根據近年來的研究調查顯示，沙門氏菌在1996—2015年引起166起食物中毒事件，造成8 996人感染[5]，金黃色葡萄球菌在2003—2015年引起86起食物中毒事件，造成2 431人感染[6]，這兩種致病菌引起的食品微生物污染尤為嚴重。我國食品安全國家標準明確規定了這兩種病原菌的限量標準，其中沙門氏菌不得檢出，而且一些阿膠制品的企業標準也有明確規定。因此，準確檢測阿膠制品中是否攜帶有活的上述致病菌及其數量，對于及時控制因其導致的感染危害具有重要意義。

目前致病菌活菌檢驗最常用的方法是傳統培養檢測法，但該方法程序繁雜、耗時長，樣本中可能含有雜菌而產生競爭性抑制，也存在對持留菌、休眠菌及代謝異質菌無法成功培養的缺陷，實際操作中可能會發生漏檢等情況。隨著活菌的快速檢測新技術不斷出現，研究者們將細菌是否具有新陳代謝活性進而產生生物活性物質，或是否具有完整的細胞結構作為判斷活菌的標準，相繼開發了ATP生物發光法、免疫學方法、mRNA檢測法、死菌/活菌熒光染色法、流式細胞術以及PCR方法等其他活菌檢測方法[7-8]。近年來，也有研究者將PCR與核酸交聯染料結合用于致病菌活菌檢測[9]，其檢測靈敏度高、特異性強，而且能夠實現多重檢測，滿足不同目標菌的同時檢測[10-11]。基于此，本研究根據沙門氏菌和金黃色葡萄球菌特異性基因設計引物和探針、優化反應條件，建立多重熒光定量PCR檢測體系，并結合疊氮溴化丙錠（Propidium Monoazide，PMA）預處理實現活菌檢測。本研究建立的PMA-mqPCR為檢測阿膠制品中活的常見致病菌提供了新參考，對控制阿膠制品的微生物安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

腦心浸出液和營養瓊脂（北京陸橋技術股份有限公司）、Premix Ex Taq?（寶日醫生物技術（北京）有限公司）、恒溫水浴鍋（上海智城分析儀器制造有限公司）、高速離心機（賽默飛世爾科技）、恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）和熒光定量PCR儀（伯樂生命醫學產品（上海）有限公司，CFX96 Touch）。

1.2 菌株和培養

本研究選取了10株標準細菌，菌株信息及來源見表1，包含目標菌4株：沙門氏菌（2株），金黃色葡萄球菌（2株）；非目標菌6株：大腸埃希氏菌（2株）、銅綠假單胞菌（1株）、蠟樣芽孢桿菌（1株）、糞腸球菌（1株）和克羅諾桿菌（1株）。所有的菌株分別在腦心浸出液和營養瓊脂（北京陸橋技術股份有限公司）中進行復蘇和純化培養，然后接種在腦心浸出液中獲取菌懸液。取1 mL細菌懸液放置在金屬浴中80 ℃熱處理10 min，得到沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的死菌懸液，并進行平板涂布，確定不存在活菌。

表1 菌株信息及來源表

1.3 引物和探針設計

根據NCBI數據庫提供的invA（沙門氏菌）和nuc（金黃色葡萄球菌）序列，使用Beacon designer 8軟件設計引物和探針，并通過BLAST進行特異性比對，表2為本研究使用的引物和探針序列，引物和探針序列委托通用生物系統（安徽）有限公司合成。

表2 引物和探針序列表

1.4 PMA濃度的優化

準備濃度為1 mg·mL-1的PMA溶液，取不同體積的PMA加入濃度為108CFU·mL-1沙門氏菌和金黃色葡萄球死菌和活菌中，使得PMA終濃度為0 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、30 μg·mL-1和40 μg·mL-1，隨后將其放置在暗處室溫孵育5 min，取出放置在冰盒上，并使用500 W鹵素燈在距離樣品管20 cm處曝光5 min，其間每隔30 s進行輕微振動，然后使用1×PBS緩沖液清洗2次，去除多余未交聯的PMA，最后重懸在200 μL超純水中，并使用水煮法提取基因組DNA[12]。不同濃度PMA處理組獲取的基因組DNA用于qPCR擴增，并通過Ct值確定最佳的PMA濃度。

1.5 mqPCR方法的建立

qPCR反應體系為25 μL：12.5 μL Premix Ex Taq?（Takara），0.5～1.0 μL invA-F（10 μmol·L-1）、0.5～1.0 μL invA-R（10 μmol·L-1），0.5～1.0 μL invA-P（10 μmol·L-1），0.5～1.0 μL nuc-F（10 μmol·L-1）、0.5～1.0 μL nuc-R（10 μmol·L-1），0.5～1.0 μL nuc-P（10 μmol·L-1），

DNA模版各2 μL。反應程序：95 ℃ 5 min 預變性，95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 30 s退火和延伸，40個循環，在退火和延伸階段采集熒光信號。通過梯度qPCR優化退火和延伸溫度，溫度范圍設置為55～65 ℃，并根據不同溫度對應的相對熒光單位（RFU）大小，確定最佳的退火和延伸溫度。

1.6 靈敏度評價

取過夜培養的目標菌株，經過PMA預處理后，采用水煮法提取基因組DNA，并使用10倍梯度稀釋法獲取濃度101～108CFU·mL-1的基因組DNA。通過對目標菌基因組DNA進行mqPCR，并根據擴增結果以Ct值為縱坐標，細菌濃度為橫坐標建立標準曲線，確定PMA-mqPCR在純培養液中的檢測靈敏度。

通過對阿膠制品進行加標檢測，進一步探究PMA-mqPCR方法檢測實際樣品中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的可行性。準備25 g阿膠制品加入225 mL 1×PBS緩沖液中制成樣品懸液，并且使用培養法確定樣品懸液不存在沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。制備的加標樣品懸液分別接種沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，使其終濃度為107CFU·mL-1，然后進行PMA預處理，并使用水煮法提取基因組DNA。通過10倍梯度稀釋獲取不同濃度的基因組DNA，并進行mqPCR擴增，確定PMA-mqPCR在加標樣中的檢測靈敏度。

1.7 特異性評價

選取4株目標菌、6株非目標菌進行純化培養，獲取菌懸液，利用水煮法提取基因組DNA，然后對基因組DNA進行qPCR擴增，確定方法的特異性。

1.8 活菌檢測

準 備500 μL濃 度 為107CFU·mL-1沙 門 氏 菌 和金黃色葡萄球菌活菌懸液，分別加入500 μL細菌濃度為100CFU·mL-1、102CFU·mL-1、104CFU·mL-1、108CFU·mL-1的死菌懸液，制備死活菌混合液，然后進行PMA預處理、基因組DNA提取，最后通過mqPCR擴增，比較各組Ct值評價活菌檢測性能。

2 結果與分析

2.1 PMA濃度的優化

PMA濃度是影響活菌檢測的重要條件，合適的濃度能夠最大程度抑制死菌DNA擴增，因此本研究探究了PMA濃度對死菌的抑制效果，優化結果見圖1。根據圖1a結果，當PMA濃度從0 μg·mL-1增加到30 μg·mL-1時，死菌處理組的Ct值逐漸升高，30 μg·mL-1增加到40 μg·mL-1的Ct值趨于穩定，圖1b金黃色葡萄球菌PMA處理濃度的優化結果與圖1a結果相似，綜合考慮抑制死菌DNA最佳擴增效果，選取PMA濃度為30 μg·mL-1為最優濃度。

圖1 PMA濃度的優化結果圖

2.2 退火溫度的優化

反應體系的退火溫度是影響qPCR擴增效果的關鍵因素，合適的退火溫度能夠極大地提高擴增效率和檢測靈敏度，為此本研究優化了反應體系的退火溫度，結果如圖2所示。圖2a是invA基因（沙門氏菌）退火溫度優化的結果，當退火溫度從55.0 ℃到57.0 ℃時，相對熒光單位逐漸增加，退火溫度從57.0 ℃到65.0 ℃時，相對熒光單位逐漸降低，圖2b是nuc基因（金黃色葡萄球菌）退火溫度優化結果，綜合考慮invA和nuc基因擴增的退火溫度優化結果，最終選取57.0 ℃為mqPCR的最佳退火溫度。

圖2 退火溫度的優化結果圖

2.3 mqPCR體系的建立

mqPCR體系是多重檢測的基礎，為實現沙門氏菌和金黃色葡萄球菌同時檢測提供了可能，體系建立結果如圖3所示。通過優化引物和探針濃度、退火溫度等反應條件，確認多重檢測體系為25 μL，包含：12.5 μL Premix Ex Taq?，0.75 μLinvA-F（10 μmol·L-1）、0.75 μLinvA-R（10 μmol·L-1），0.5 μLinvA-P（10 μmol·L-1），0.5 μLinvA-F（10 μmol·L-1）、0.5 μLinvA-R（10 μmol·L-1），0.5 μLinvA-P（10 μmol·L-1），DNA模版各2 μL，超純水5 μL。反應程序為：95 ℃ 5 min預變性，95 ℃ 15 s變性，57 ℃ 30 s退火和延伸，40個循環。

圖3 多重體系的建立圖

2.4 檢測性能

為評價PMA-mqPCR同時檢測沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測性能，本研究對純菌液中的目標菌株進行了檢測，以確定方法的檢測靈敏度。純菌液檢測限結果見圖4a，其中沙門氏菌的檢測限為102CFU·mL-1，且在102～108CFU·mL-1具有良好的線性相關性（R2=0.997 5），標準曲線為y=-3.09x+42.83；金黃色葡萄球菌的檢測限為101CFU·mL-1，且在101～108CFU·mL-1具 有 良 好 的 線 性 相 關 性（R2=0.997 2），標準曲線為y=-3.076x+39.38。

為評價PMA-mqPCR檢測實際樣品的能力，本研究對阿膠制品進行加標檢測，以確定該方法的實際應用效果。人工加標檢測結果見圖4b，其中沙門氏菌的檢測限為103CFU·mL-1，且在103～107CFU·mL-1具有良好的線性相關性（R2=0.998 6），標準曲線為y=-2.977x+42.86；金黃色葡萄球菌的檢測限為103CFU·mL-1，且 在103～107CFU·mL-1具 有良好的線性相關性，（R2=0.998 8），標準曲線為y=-3.468x+48.43。

圖4 檢測限評價結果圖

2.5 特異性評價

為評價PMA-mqPCR檢測不同細菌的選擇性，本研究選取了4株目標菌株，6株非目標菌進行特異性驗證。特異性結果如表1所示，其中invA基因只能擴增沙門氏菌基因組DNA，非目標菌無陽性結果，nuc基因只能擴增金黃色葡萄球菌基因組DNA，非目標菌無陽性結果。結果表明，本研究建立的PMA-mqPCR具有良好的特異性，能夠準確地同時檢測沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。

2.6 活菌檢測能力

為探究PMA用于活菌檢測的效果，本研究分別在107CFU·mL-1活菌液中加入等體積的100CFU·mL-1、104CFU·mL-1、106CFU·mL-1和108CFU·mL-1死菌液。活菌檢測結果如圖5所示，各組Ct值基本持平，其中沙門氏菌活菌回收率為95.70%（104CFU·mL-1）、96.53%（106CFU·mL-1）、105.62%（108CFU·mL-1），金黃色葡萄球菌的回收率分別為100.60%（104CFU·mL-1）、97.63%（106CFU·mL-1）、96.74%（108CFU·mL-1），綜合考慮各組Ct值以及回收率，表明本研究建立的PMA-mqPCR具有較好的活菌檢測效果。

圖5 活菌檢測效果圖

3 結論和討論

本研究根據沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的特異性基因設計引物和探針，結合PMA預處理，建立多重熒光PCR活菌檢測體系，在最優條件下，PMA-mqPCR用于純菌液中沙門氏菌的檢測限為102CFU·mL-1，金黃色葡萄球菌的檢測限為101CFU·mL-1，阿膠制品加標樣的檢測限均為103CFU·mL-1。通過PMA預處理，結合多重熒光檢測體系，能夠實現同時對多種致病菌活菌檢測，而且活菌回收率高。

目前致病菌活菌檢測技術應用最廣泛、最簡單的是傳統培養法，通過一系列的增菌、選擇性培養、生化鑒定實現活菌檢測，但這種方法不光費時費力，而且對一些處于非可培養狀態的細菌無法鑒定[13]。本研究根據死活菌細胞膜的完整度不同，利用核酸交聯染料PMA無法進入細胞膜完整的活細菌，死菌細胞膜不完整使得PMA能夠跨過細胞膜與細菌基因組DNA發生不可逆結合[14]，通過提取細菌基因組DNA用于qPCR擴增，死菌基因組DNA無法成功變性使其不能延伸，而活菌DNA不受影響，實現活菌檢測。

熒光定量PCR用于致病菌檢測，靶基因的選擇及引物和探針設計直接關系到檢測體系的特異性和靈敏度，選擇合適的靶基因和設計適用于多重檢測引物和探針至關重要。本研究分別選取沙門氏菌invA基因和金黃色葡萄球菌nuc基因為靶基因，其中invA基因編碼沙門氏菌III分泌系統InvA蛋白[15]、nuc基因編碼金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶[16]，并且有研究報道invA[17]和nuc[18]分別是沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的特異性基因。本研究通過Beacon designer軟件設計引物和探針，結果顯示引物和探針的Tm值均符合多重熒光定量PCR設計標準，并且多重檢測體系的建立也進一步證明引物和探針設計的合理性，為實現沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的同時檢測奠定基礎。