蘋果糖轉運蛋白基因家族篩選鑒定

◎ 闞東揚，冉秋月，唐玉鳳，楊潤森

（1.昭通學院 農學與生命科學學院，云南 昭通 657000；2.滇東北高原特色農業研究中心，云南 昭通 657000）

可溶性糖積累由合成、降解、轉運以及貯存等過程共同決定，而較為關鍵的是轉運環節[1]，研究糖相關轉運蛋白對完善果實糖品質性狀遺傳與發育機理具有重要意義[2]，而且糖轉運蛋白在植物應對逆境脅迫方面也起著重要作用。擬南芥作為一種模式植物，在糖轉運蛋白方面的研究已比較成熟，目前從擬南芥中分離出69種相關的糖轉運蛋白（SWEET）。SWEET基因家族是一類植物己糖和蔗糖轉運蛋白，包含4個亞 家 族[3]，Clade I包 括SWEET1-SWEET3，Clade II包 括SWEET4-SWEET8，Clade III包 括SWEET9-SWEET15，Clade IV包 括SWEET16-SWEET17[4]，目前對于SWEET基因家族的研究較少。擬南芥中的糖轉運蛋白不僅能夠參與ABA誘導的糖代謝途徑[5]，而且可受低溫、鹽脅迫等的誘導參與逆境脅迫與糖信號代謝[6]。糖轉運蛋白在植物碳水化合物的長距離運輸中起重要作用，并參與植物的生長發育、能量運輸與調節，與經濟作物蘋果的產量和品質直接相關[7]。

我國是蘋果生產大國，蘋果產量約占世界產量的一半，其中昭通蘋果以富含多種果糖以及微量元素而馳名國內。昭通蘋果產區與全國其他蘋果產區相比，具有明顯的區位優勢、早熟優勢、生態優勢和品質優勢，為中國南方高原蘋果優質生產基地之一[8]。但昭通地處高寒山區，早春干旱、冬季過暖，并且冰雹和霜害等災害性天氣頻繁發生，因此對培育抗逆性強且糖含量高的蘋果品種較為迫切。糖含量是決定蘋果風味、品質的關鍵因素之一，而糖分的積累主要是多種糖轉運蛋白共同協作的結果，因此，鑒別這些糖轉運蛋白對于蘋果選育和改善含糖量具有重要意義。本研究通過獲取糖轉運蛋白序列，進行糖轉運蛋白在逆境脅迫中的基因差異表達量分析，篩選抗性強的糖轉運蛋白基因，旨在為昭通蘋果分子育種和優良品種選育提供參考依據。

1 選定基因家族

選擇擬南芥中糖轉運蛋白家族的基因，通過NCBI，利用database數據庫對其進行聚類分析，如圖1。根據聚類分析圖，將得到的3種基因型植株的糖轉運蛋白表達量數據繪圖，如圖2。

圖1 擬南芥糖轉運蛋白基因聚類分析圖

圖2 3種糖轉運蛋白在逆境下表達量差異圖

由圖2可以看出，在強逆境環境下野生型植株的3種糖轉運蛋白基因表達量相較于突變體植株有極顯著的提高，在低強度逆境下野生型植株的3種糖轉運蛋白基因表達量也明顯高于突變體植株，這表明糖轉運蛋白與抵御逆境脅迫有明顯的正相關關系。

2 蘋果糖轉運蛋白鑒定分析

2.1 蘋果糖轉運蛋白基因家族親緣關系分析

蘋果屬于薔薇科植物，糖轉運蛋白家族在進化上又具有一定的保守性，因此選取擬南芥、其他薔薇科植物以及蘋果，對它們構建糖轉運蛋白基因的進化樹，如圖3。

通過構建進化樹由圖3可以看出，可以看到在進化樹上，大于72的區間內，蘋果和擬南芥的糖轉運蛋白：sweet1、sweet4、sweet1和sweet3具有較近的親緣關系，在基因的進化上具有一定的保守性。

圖3 糖轉運蛋白基因進化樹圖

2.2 蘋果糖轉運蛋白染色體定位

通過對蘋果和擬南芥糖轉運蛋白基因，sweet4、sweet1進行序列比對，發現蘋果的sweet1與擬南芥的sweet4在序列上有70%的相似性，進化樹分析也支持蘋果和擬南芥的糖轉運蛋白基因家族有較近的親緣關系，利用GDR（http://www.rosaceae.org/）庫進行分析，發現在蘋果的16號染色體上存在與擬南芥sweet12具有很高相似性的一段序列，對其進行染色體定位，如圖4所示。

圖4 sweet12在蘋果染色體上的定位圖

由圖4可以看出，該片段在蘋果16號染色體上，長度約為2.2 kb，并鑒定出其相應的內含子與外顯子。

3 結論與討論

3.1 糖轉運蛋白與抵御逆境脅迫有正相關關系

聚類分析表明，糖轉運蛋白家族與抗植物逆境脅迫有明顯的正相關關系，研究糖轉運蛋白基因在不同時期、不同植物體內的相對表達量變化有助于人們更好地認識植物與環境之間的互動。

3.2 蘋果和擬南芥的糖轉運蛋白具有較近的親緣關系

通過構建糖轉運蛋白基因進化樹，發現蘋果和擬南芥的糖轉運蛋白家族具有較近的親緣關系，這為研究蘋果糖轉運蛋白家族提供了相近的模式植物，為蘋果糖轉運蛋白家族的研究以及功能鑒定提供了便利。

3.3 SWEEET12可能是參與抵御逆境脅迫的關鍵酶基因

通過對擬南芥糖轉運蛋白家族序列的聚類比對，可以看出AtSWEEET12與抵御逆境脅迫有著明顯的正相關關系，說明SWEEET12極有可能是參與抵御逆境脅迫的關鍵酶基因。已有研究證明，蘋果糖轉運蛋白基因與擬南芥AtSWEET成員蛋白在同一個進化枝上，參與糖代謝相關轉運功能[9]，MdSWEET12基因染色體定位預測結果也證實SWEET12基因在蘋果16號染色體上。利用NCBI上的擬南芥AtSWEEET12蛋白序列Blast比對蘋果基因組中MdSWEEET12，后續可對其進行亞細胞定位、定量表達分析等一系列研究，進一步分析其在蘋果中的功能，為蘋果育種和優良品種選育奠定基礎。