杜鵑花屬植物組織培養技術研究進展

宦智群，耿興敏

（南京林業大學風景園林學院，江蘇 南京 210037）

杜鵑花是杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（Rho?dodendron）植物的總稱，我國傳統十大名花之一，被譽為“花中西施”，具有很高的觀賞和應用價值。杜鵑花屬植物可以采用種子、扦插、壓條和嫁接方法繁殖，但種子繁殖不利于優良株系的保存，扦插方式繁殖存在母株材料稀少、生根率低以及移栽成活率不高、苗生長不整齊和受季節性限制等問題［1］，都不利于進行大量的商業化生產。組織培養與傳統的繁殖方式相比，不受季節和環境條件等因素的影響，具有繁殖速度快、繁殖系數大的優點，能在短期內生產出市場所需的大量優質苗木，為杜鵑花屬植物的快速繁殖提供了一條可行的途徑。組織培養已成為杜鵑花屬植物繁殖的重要手段，廣泛應用于無性系苗木的商業化生產中，并且為種質資源保存與創新提供技術基礎。

從組織培養的再生途徑、試管播種、存在的技術問題、組培技術的應用等方面探討杜鵑花屬植物組培的研究進展，以期對杜鵑花屬植物優良品種的保存、優良種苗的工廠化生產及野生資源的開發利用提供理論基礎。

1 再生途徑

木本植物組織培養再生途徑有無菌短枝扦插、器官發生、體細胞胚發生。在杜鵑花屬植物中，前兩種發生途徑研究較多。

1.1 無菌短枝扦插

1.1.1 外植體的選擇及取材時間

無菌短枝扦插一般選取莖尖、帶腋芽的幼嫩莖段或頂芽、側芽作為外植體。一般來說，不同外植體的出芽率：莖尖＞莖段＞頂芽＞側芽［2-4］，這些外植體的最佳采取時期為3～4月。

1.1.2 初代培養

初代培養常用Read、改良MS、1/4MS等培養基。不同類型的生長素1-萘乙酸（1-Naphthylacetic ac?id，NAA）、吲哚-3-丁酸（3-Indolebutyric acid，IBA）、吲哚-3-乙酸（3-Indoleacetic acid，IAA）的效果差異不明顯，不同類型的細胞分裂素激動素（Kinetin，KT）、6-芐基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）、玉米素（Zeatin，ZT）差異極其顯著，ZT的效果明顯好于KT和6-BA［5］。ZT具有較強的誘導分化作用，能促進莖段外植體的頂芽伸長和腋芽萌發［6］，適宜濃度為1～3 mg/L。ZT和其他生長素（NAA、IBA、IAA）組合對外植體的出芽誘導率較高（表1）。由于杜鵑花屬植物是酸性土指示植物，培養基要保持較低pH值，pH值一般在5.5～6.0之間?；钚蕴浚ˋctive car?bon，AC）的添加有利于芽的誘導，活性炭與激素的適宜濃度配比，可以保證較高的出芽率［7］。

表1 杜鵑花屬植物無菌短枝扦插研究Table 1 In vitro shoot propagation of Rhododendron plants

1.1.3 繼代培養

繼代培養常使用的基礎培養基為Read和WPM培養基。不同種類的杜鵑花屬植物對不同培養基類型的反應存在差異。大樹杜鵑（R.protistumvar.gi?gantum）帶芽莖段增殖時Read和WPM之間差異不顯著，而對于桃葉杜鵑（R.annae）Read培養基效果最好［8-9］。對于雜交杜鵑莖段芽的增殖，WPM較好［10］。蔗糖濃度與離子培養基強度的相互作用是顯著的，Hsia和Korban［11］研究表明在低蔗糖水平（58.4 mM）下，高離子培養基強度處理（2X）的芽增殖率最高；而在低離子培養基強度（0.5X）下，87.6 mM蔗糖下的芽增殖率較高。

繼代培養基中常添加的激素為ZT、KT、異戊烯腺嘌呤（2-Isopentenyl，2-iP）以及NAA等。一般ZT是杜鵑花屬植物組培增殖最為理想的外源激素，濃度以0.5～1 mg/L為宜。在國外，細胞分裂素2-ip在增殖中應用最廣泛，適宜濃度為0.5～1.5 mg/L。ZT或2-iP都能產生較高生根率的優質芽，但ZT對某些種類杜鵑花屬植物的增殖效果更好［12］。噻苯隆（Thidiazuron，TDZ）對芽增殖有較強的促進作用，但其芽通常扭曲、致密、含有過多水分，因此較少用于增殖。NAA是繼代增殖常使用的生長激素，對芽的生長影響很大，與細胞分裂素配合使用，有著很好的增殖效果，因其可以對抗過量的細胞分裂素帶來的不良效果從而產生更健壯的芽［12］。其他生長素IBA、IAA對帶芽莖段、不定芽的增殖均有一定促進［13-14］，同時添加NAA和IAA有一定的交互促進作用［14］。

在增殖培養時，要注意芽的數量與質量的平衡，保證增殖芽苗均勻健壯。質量與數量較理想的平衡點是保持增殖率4～5倍，可為快速繁殖優質種苗奠定良好基礎［15］。增殖率的高低，主要是通過細胞分裂素的用量及培養室的溫度調節進行控制。

1.1.4 壯苗培養

當組培苗細弱難以誘導生根時，壯苗培養不可或缺。培養基中ZT濃度較低時有利于組培苗的健壯生長［16］。1～2 mg/L的赤霉素（Gibberellin，GA3）常用于壯苗培養［6，17-18］；加入適量的AC、適當調高培養基中磷素養分濃度都有一定壯苗作用［9，14］。

1.1.5 生根培養

1.1.5.1 培養基與激素低鹽分濃度、高硝酸銨比值的培養基如Read、MS、1/2 MS適合杜鵑花屬植物的生根培養［5，19-20］，生根培養基的適宜pH值為5.0～5.5。生長素IBA、NAA、IAA均有一定的生根促進效果，一般IBA的生根效果最好，適宜濃度為0.5～1 mg/L［18，21］。2 mg/L以上濃度的NAA配以1 mg/L的IBA，對大白杜鵑（R.decorum）組培苗生根有一定促進作用［17］。IBA與NAA混合使用的生根數量和質量明顯強于各自單獨使用［15，22］，IAA和NAA的同時加入也能促進組培苗的生根速度、提高生根率［23］。

1.1.5.2 其他添加物質與培養條件培養基中的蔗糖能為培養物的生長和發育代謝提供所需的能量和底物，并影響培養基的滲透勢。蔗糖影響著組培苗的葉色、平均生根數。適宜的蔗糖濃度一般在15～30 g/L之間。AC也能促進生根，濃度在2～4 mg/L能達到最佳的生根效果。生根培養的最適培養溫度是23～27℃［19］。在生根階段添加適量的黃光能促進根系的形成［24］。

1.1.5.3 生根方式瓶內生根與瓶外生根的方式在杜鵑花屬植物組培苗生根培養中都有采用。瓶內生根又分為將繼代苗接種于培養基和在培養瓶內加入基質進行瓶內微型扦插兩種方式，從苗的健壯程度及根系數量來看，瓶內微型扦插培養方式比采用固體培養基好［25］。大多數研究表明，相對于瓶內生根，瓶外生根方式更佳。IBA液體脈沖處理組培苗后進行瓶外生根，使生根時間縮短了兩倍，且與瓶內生根相比生根率高、根的質量更好、芽長更長、馴化時間更短［26］。瓶外生根技術是解決西鵑組培生根率低的有效途徑，在酸性基質條件下能提高西洋杜鵑組培苗生根率，生根促進劑GGR6的添加效果優于ABT1［27］。

1.1.6 馴化與移栽

杜鵑花屬植物移栽多采用“二步法”（假植和上盆移栽）的組培苗假植育苗技術［18，25］。泥炭、腐殖土、蛭石、珍珠巖是杜鵑花屬植物組培苗移栽最為常用的基質。杜鵑花屬植物煉苗馴化與移栽往往采用混合基質。腐殖土和蛭石的混合物有利于移栽苗的存活，珍珠巖代替蛭石使用或二者混合效果也較好。在引種栽培中引入菌根技術可以解決杜鵑花屬植物移栽苗生長緩慢、成活率低等難題，顧地周等［28］應用菌根真菌配置的菌液對基質先進行處理，使菌根真菌在基質中進行大量繁殖后再行植入種苗的方式，提高了移栽后的成活率。

選擇適宜的組培苗移栽時期能提高移栽成活率。例如興安杜鵑（R.dauricum）組培瓶苗出瓶移栽（實驗地區：吉林）最好選擇在秋、冬季進行，選擇陰天的下午18：00左右出瓶，移栽存活率最高可達91.56%［29］。環境條件可控的溫室有利于組培苗移栽成活，移栽后應該適當遮光，溫室加棚膜可以提高幼苗成活率。杜鵑花屬植物大多喜溫暖、半陰、涼爽、通風、濕潤的環境。保持平均溫度在26℃左右［30］，幼苗上盆恢復生長后要及時施肥，薄肥勤施，能淡莫濃［31］。苗期應注意病害的防治。

1.2 器官發生

1.2.1 間接器官發生

1.2.1.1 愈傷組織誘導在杜鵑花屬植物的間接器官發生研究中，已成功誘導出愈傷組織的外植體有：葉片、上胚軸、下胚軸、莖段、莖尖等（表2）。不同外植體愈傷誘導率為：上胚軸＞下胚軸＞嫩葉［35］。在葉片的愈傷培養中，嫩葉的生長勢好于全展葉［9］，葉片不同部位愈傷組織的再生能力依次為：葉尖＞葉基＞葉中，葉片接種方式選擇正面向上進行誘導較好［36］。暗處理能促進愈傷組織的誘導［36］。

葉片誘導愈傷組織一般使用WPM培養基，莖尖、莖段、上下胚軸的愈傷組織誘導常用1/2MS、1/4MS培養基（表2）。細胞分裂素TDZ和ZT常用于愈傷組織誘導［35，37-38］。生長素中NAA在愈傷組織的誘導中運用較多且效果較好［8］，濃度一般為0.2～1 mg/L。

表2 杜鵑花屬植物間接器官發生途徑研究Table 2 Indirect organogenesis of Rhododendron plants

1.2.1.1 不定芽分化誘導不定芽分化的基礎培養基常用與愈傷組織誘導同樣的培養基，常添加ZT、TDZ、NAA等激素。TDZ對愈傷組織及不定芽分化的誘導能力顯著優于ZT，適宜濃度為0.2～0.5 mg/L。而ZT相對于TDZ，在較高濃度時才有較好的效果［39］。且TDZ和ZT處理后分化的芽在數量和質量上存在明顯差異：ZT處理后可再生出形態良好、易生根的芽，而TDZ處理的再生芽數量更多，但長度短、形成叢生，且難以生根［39-40］。所以TDZ處理后的芽在生根前需要進行壯苗培養，ZT處理后的芽則不需要壯苗的步驟［40］。TDZ可以與2iP、NAA配合用于不定芽的誘導。Briggs［41］報道了TDZ和2iP的結合提高了落葉杜鵑再生芽的產量和品質。NAA+TDZ處理比TDZ單獨處理更好地誘導了幾個杜鵑花屬植物栽培品種的不定芽的形成［37］。

1.2.2 直接器官發生

杜鵑花屬植物可以通過葉片、花蕾直接分化出不定芽，形成完整植株。嫩葉直接誘導不定芽常用1/4MS、WPM、Anderson培養基，一般較高濃度的細胞分裂素與適當濃度的細胞生長素有利于葉片直接誘導不定芽。高濃度的ZT和適當濃度的NAA適合苞葉杜鵑（R.bracteatum）嫩葉直接再生芽苗，高濃度的ZT、低濃度的IAA和適當濃度的KT有利于誘導牛皮杜鵑（R.aureum）嫩葉直接再生芽苗，高濃度的2-ip有利于高山杜鵑（R.lapponicum）葉片直接分化長出不定芽（表3）。蘇家樂等［1］首次將細胞分裂素氯吡苯脲（CPPU）用于杜鵑葉片直接誘導不定芽，發現CPPU對‘江南春早’葉片直接再生不定芽具有較強的誘導作用，暗培養可以顯著提高‘江南春早’葉片不定芽的誘導率。

表3 杜鵑花屬植物直接器官發生途徑研究Table 3 Direct organogenesis of Rhododendron plants

花蕾直接誘導不定芽常使用ER培養基（1965年由Eriksson設計，與MS培養基相似，磷酸鹽含量比MS高），ER培養基中高濃度的P、K有利于下一步的繼代或無根苗直接外移成苗。ZT對花蕾誘導不定芽有良好的效果，附加量不必太多［47］，KT也有較好的效果［36］。

2 試管播種

種子作為組培材料，有取材方便，不傷害母株、方便攜帶和保存時間長等優點［17］。試管播種，培育種子無菌苗作為外植體，可減少污染、提高組培的成功率。

2.1 種子的獲取與滅菌

一般選擇成熟的種子，取材時間為10月～12月。對于開裂的蒴果，將種子從蒴果中取出滅菌；對于未開裂的蒴果，可直接對蒴果滅菌。滅菌的一般步驟為：流水下沖洗1～2 h，用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗后用0.1%升汞溶液消毒7～10 min，再用10%H2O2或NaClO溶液消毒5～10 min，無菌水沖洗后用濾紙吸干表面水分，將種子撒播于種子萌發培養基上［17，31］。

升汞消毒的時間越長，污染率越低，但死亡率及褐化率越高。吳雅文等［48］發現分段消毒的方法（即第1個消毒時間過后，在無菌水中清洗種子，給其一個暫緩時間，再進行第2次消毒）明顯優于一次性的消毒，3 min+3 min的消毒時間最有利于迷人杜鵑（R.agastum）種子無菌萌發。在升汞等滅菌劑中往往加入幾滴0.1%Triton X-100，能夠使消毒更徹底。在常規消毒方法的基礎上加入混勻器震蕩，也可以獲得良好的滅菌效果［49］。

2.2 種子萌發培養基及培養條件

對于成熟的種子而言，種子萌發培養基中往往不添加任何激素，常用1/4MS［49］、WPM［9，50］等作為基礎培養基。適宜的種子萌發培養基種類因杜鵑花屬植物的種類而異，如WPM作為美容杜鵑（R.calo?phytum）的種子萌發培養基，效果優于MS培養基［50］。

在培養基中加入激素能更好地促進種子萌發和生長［50］，加入1 mg/L的KT使得馬纓杜鵑（R.delavayi）種子發芽率高，萌發后的小苗生長良好［6］；1 mg/L的GA3不僅能提高大樹杜鵑和桃葉杜鵑的發芽率、使發芽時間提前，還具有一定壯苗作用［13］。種子萌發的適宜條件為：pH 5.2～5.8，溫度25±2℃，相對濕度為50%～60%，光照14～16 h/d，光照強度1800～2500 lx左右［6，49］。

在雜交育種中，常利用胚離體培養的方法進行杜鵑花屬植物雜交幼胚的挽救。Anderson、WPM、MS等作為啟動培養基在杜鵑花雜交胚拯救中都有所應用［12，51-52］，最佳基本培養基的類型要根據雜交種類具體探討。培養基中常常添加赤霉素（50～150 mg/L），可以誘導雜交胚的進一步發育，提高萌發率［12，51-52］。

3 常見技術問題

3.1 污染控制

杜鵑花屬植物組織培養中的污染主要來源于外植體，一些外植體材料如莖段、葉片，密被絨毛，滅菌困難。可以從外植體的選擇和滅菌處理方式兩方面來控制污染。要選擇本身不易污染的外植體如花蕾、胚，此類材料不易得的情況下就需要控制外植體野外采集的時期：采用4～5月份新生的葉、莖尖、枝條，污染率可下降20%～30%［64］。從溫室中取材可有效減少附生菌的數量，培育無菌苗作為外植體也是有效的辦法。酒精（75%）、升汞（0.1%～1%）、次氯酸鈉（2%～10%）是杜鵑花屬植物組培中最常用的滅菌劑，一般認為升汞滅菌方式較好，滅菌劑的選擇與滅菌時間要根據不同的外植體具體探討。

3.2 褐化

杜鵑花屬植物是木本植物，含有較多的酚類化合物，導致組織培養過程中的高褐變率。選擇適宜的外植體和取材時間能減輕褐變程度?？偡雍亢投喾友趸福≒PO）是影響杜鵑花屬植物組培褐變的兩大因素。莖段的總酚含量、PPO活性低于葉片、莖尖，是理想的外植體。4月份PPO活性和總酚含量相對較低，是理想的取材時間［65］；暗培養有一定的抗褐效果，最佳時間為10 d；在培養基中添加一定濃度AC抗褐效果較好［21］；轉接也能減輕褐化現象［65］。

3.3 玻璃化

控制玻璃化要從培養條件和生理生化方面入手。根據何芳蘭［66］的研究，控制玻璃化的有效措施有：（1）增加蔗糖和瓊脂的濃度，以3%～4%蔗糖和0.6%瓊脂較好；（2）降低培養容器內部環境的相對濕度；（3）適當降低培養基中細胞分裂素濃度；（4）適當低溫處理，晝夜變溫交替；（5）增加自然光；（6）增加培養基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu元素含量，降低N和Cl元素比例，特別是降低銨態氮濃度，提高硝態氮含量；（7）改善容器通風換氣條件，用棉花塞代替塑料封口膜。

4 組培技術的應用

4.1 育種

4.1.1 多倍體育種

杜鵑花屬植物多倍體的培育往往是采用秋水仙素、氨磺靈、氟樂靈等有絲分裂抑制劑對離體莖尖、愈傷組織進行誘導。Vainola［53］用秋水仙素和氨磺靈對杜鵑花的離體莖尖進行處理，成功誘導出四倍體杜鵑；Hebert等［54］在葉片愈傷組織的不定芽誘導培養基中添加氨磺靈進行誘導，獲得可育的四倍體。彭綠春等［55］用0.15%秋水仙素浸泡處理腋花杜鵑（R.racemosum）無菌幼苗的莖段，通過莖段側芽及其基部愈傷組織分化的叢生芽分離變異株，得到四倍體腋花杜鵑。此外，De Schepper等［56］發現，在二倍體雜交的植株上異于花瓣顏色的邊緣組織是四倍體，用花瓣邊緣組織為材料，進行離體組織培養，成功獲得了四倍體比利時盆栽杜鵑。

4.1.2 基因工程育種

莖段、葉片離體再生體系的建立可用于杜鵑花屬植物的遺傳轉化研究。Ueno等［57］以品種杜鵑花的莖、葉作為共培養材料，通過農桿菌介導，將NT?PII和β～GUS基因整合到植物體內。Dunemann等［58］利用莖段培養，通過農桿菌介導法對幾種常綠的杜鵑花屬植物轉化了農桿菌的rolB和Fro2基因。高文強［59］以映山紅（R.simsii）葉片愈傷組織為受體材料，利用農桿菌介導法將Na+/H+逆向轉運蛋白基因AtNHX1成功導入映山紅基因組中，建立了映山紅遺傳轉化體系。Knapp等［60］以R.catawbiense葉片為外植體進行離體培養，利用基因槍法轉入報告基因ui?dA和GFP。

4.1.3 誘變育種

器官組織再生尤其是葉片再生的組培技術常用于杜鵑花屬植物耐鹽、堿突變體的篩選。王長泉和宋恒［42］用60Coγ射線做誘變劑，對西鵑品種‘王冠’離體葉片產生的不定芽進行了耐鹽篩選，獲得了耐鹽的突變系，且表明選取杜鵑花屬植物葉片作為組織培養材料選育突變體會提高變異頻率并簡化篩選程序。孫振元等［43］利用由NaHCO3建立的高pH值篩選培養基對毛白杜鵑（R.mucronatum）組培葉片再生的叢生芽進行了耐堿篩選，獲得耐堿突變體植株。組培快繁技術為誘變后變異植株的保存提供技術支持。蘭熙［49］以照山白（R.micranthum）和迎紅杜鵑（R.mucronulatum）的無菌苗莖段為外植體建立了組織培養體系，用于輻射誘變后變異株的保存和擴繁。

4.2 種質資源保存

常溫條件下，利用“低營養矮化常溫”的方法在試管內保存杜鵑花屬植物的種質資源［33］。杜鵑花屬植物組培苗常用的離體保存生長調節劑有丁酰肼（Daminozide，B9）、脫落酸（Abscisic acid，ABA）、多效唑（Paclobutrazol，PP333）等。牛皮杜鵑的種質試管保存培養基為：1/6 MS（大量元素）+1/4 MS（微量元素）+1/2 MS（鐵鹽）+1/4 MS（有機物質）+B93.5 mg/L［33］；照山白試管保存培養基為N-68+B92.3 mg/L+根皮苷1.5 mg/L，保存時間可達36個月以上［61］。二喬杜鵑組培苗較為理想的離體保存培養基為：WPM+ABA 0.5 mg/L+PP33320 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L，保存200 d后存活率達75%以上［62］。大多數研究是以新生嫩芽為外植體，通過嫩芽基部直接再生芽苗進行離體保存，但利用杜鵑花屬植物的莖尖、嫩葉、花蕾通過直接分化不定芽從而形成組培苗進行離體保存最為合適，其離體培養技術的完善對杜鵑花種質資源長期穩定保存意義重大［62］。

4.3 獲得次生代謝產物

組培苗具備代替原植物提取藥用成分的可能性，因為組織培養的過程中產生的代謝物質，有很多是有藥用價值的。于秋艷［63］測定了牛皮杜鵑組培苗中蘆丁與單寧酸等有效成分含量，發現組培苗對其藥用價值的開發具有現實意義。牛皮杜鵑組培中產生的愈傷組織中蘆丁與單寧酸含量均高于組培苗，若愈傷組織可直接入藥，其大規模培養將具有更廣闊的前景。

5 結論與展望

國內外研究者在杜鵑花屬植物組織培養的外植體選擇、基本培養基篩選、植物激素種類及濃度選擇等方面進行了大量研究，并取得了較好成果，針對常見的技術問題也提出了相應的對策。但成功進行組織培養的杜鵑花種類有限，大多是常綠杜鵑花，落葉杜鵑花很少。部分種類仍存在長勢弱、增殖率及生根率低的情況。杜鵑花屬植物的種和品種間存在差別，因此探索建立與優化更多杜鵑花屬植物的組培再生體系仍是需要解決的問題。

在外植體方面，以莖尖、莖段、葉片、花芽、胚軸、種子等外植體進行培養都取得了成功，但幾乎未見細胞、原生質體、花藥培養等更高層次的研究。體細胞胚胎發生的再生途徑還未見研究。體細胞胚胎發生具有遺傳穩定、再生頻率高等優點，是人工種子的技術基礎、制備原生質體的材料，間接體胚發生過程中產生的無性系變異有利于突變體的選擇。因此，探索杜鵑花屬植物的體細胞胚胎發生的再生途徑對相關的種質資源保存、遺傳改良和細胞分化和全能性機理的研究有重要意義。

在組培技術的應用方面，組培技術結合多倍體育種、基因工程育種、篩選突變體等的研究都較少，且處于起步階段。建立和優化不同外植體的離體再生體系并將其應用于育種、種質資源的保存等方面也具有現實意義。