減肥類保健食品中非法添加物快速測定分析

胡飛杰，王 迪，余恒琳，朱毛毛，徐 寧，王超璠，戴彩霞

（南京市產品質量監督檢驗院，江蘇 南京 210019）

近些年減肥類保健食品熱銷，面對巨大的市場和利益的誘惑，一些不法廠商為了追求療效，在保健食品生產過程中盲目添加一些非法添加藥物［1-2］。西布曲明最早是用于治療抑郁癥的藥品，后來無意中被發現其減重作用更強，于是被藥企用于減肥藥研發［3］。長期過量或濫用西布曲明可使血糖升高，血鉀降低，會引起厭食、內分泌紊亂、心律不齊、高血壓、神經系統損傷、肝功能異常等不良癥狀，后果非常嚴重［4-6］。儲蓉等［7］通過對84批減肥類保健食品中非法添加化學物質的數據分析發現：減肥類保健食品中非法添加的化學物質以鹽酸西布曲明、酚酞比較常見。減肥類的保健食品近幾年檢出率較高的添加的違禁藥物還有鹽酸西布曲明衍生物等［8-10］。

目前有很多關于減肥類保健食品中鹽酸西布曲明和酚酞的檢測方法的研究，主要的檢驗方法有液相色譜法［11］、氣相色譜-質譜聯用法［12］、液相色譜-質譜聯用法［13］、離子遷移譜法［14］等。質譜雖然檢測靈敏度高，但也有弊端。據有關報道，不法商販是憑感覺隨意添加西布曲明等非法添加藥物，一旦檢出，其含量就比較高［15］，直接進氣相色譜質譜或液相色譜質譜聯用儀，儀器極易污染，而質譜儀器價格昂貴，成本明顯增高。若多次稀釋再進質譜，則會造成誤差大定量不準確。涂鳳蓮等［16］利用液相色譜測定西布曲明及其兩種衍生物、酚酞，檢測分析時間較長，色譜峰的分離度不好。減肥類中成藥和保健食品補充檢驗方法和檢驗項目批準件2012005［17］中，液相色譜儀器條件表述不明確，且很少對液相色譜法進行優化，色譜峰有拖尾現象。本研究針對檢出率較高的鹽酸西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明和酚酞這四種物質建立高效液相色譜法。對液相色譜儀器參數進行優化，篩選出最佳色譜儀器條件，并利用光譜進行確證。另外還對液質色譜法中離子對進行優化，選用3～4離子對進行校驗，進一步提高液質色譜確證的準確度。從技術方面進行突破，為市場監管節約時間與成本，對保證保健食品的質量安全具有非常重要的意義。

1 儀器與試劑

1.1 試驗儀器

1260-液相色譜儀（美國安捷倫公司）；6470-液相色譜-質譜儀（美國安捷倫公司）；KQ-500DE型-數控超聲波（昆山市超聲儀器有限公司）；IKA Vor?tex2-渦旋儀器（德國IKA公司）；Milli-Q-超純水儀（默克化工技術（上海）有限公司）；SQP-電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司公司）；TDZ5-臺式低速離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）。

1.2 試驗材料與試劑

兩種不同劑型市售的聲稱減肥類保健品。

膠囊劑產品名稱：美林康牌左旋肉堿綠茶膠囊，生產廠家：威海南波灣生物技術有限公司，產品批號：A03200915A。

茶劑產品名稱：碧生源?牌常菁茶，生產廠家：北京澳特舒爾保健品開發有限公司，產品批號：04200602。

超純水，乙腈、甲醇（色譜級，上海安普科技股份有限公司），乙酸（≥99.5%，分析純，上海泰坦化學有限公司），乙酸銨（≥98.0%，特優級，上海泰坦化學有限公司）；標準物質：酚酞（99.8%，北京曼哈格生物科技有限公司）、鹽酸西布曲明（99.5%，中國食品藥品檢定研究院）、鹽酸N-單去甲基西布曲明（99.4%，北京曼哈格生物科技有限公司）、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明（98.9%，北京曼哈格生物科技有限公司），見表1。

表1 4種非法添加物的基本信息Table 1 Basic information of four illegal additions

2 研究方法

2.1 樣品的制備

減肥膠囊：取20粒膠囊內容物充分混勻；減肥茶：取20 g袋裝茶充分混勻；精密稱取混勻的樣品1.0000 g，于25 mL容量瓶中，加15 mL甲醇，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放置室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻后離心，取上清液，即得。

2.2 標準溶液配制

2.2.1 標準儲備液

分別精密稱取鹽酸西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、酚酞4種標準品置于10 mL棕容量瓶中，加入5 mL甲醇，超聲溶解20 min，放冷至室溫，用甲醇定容至刻度，渦旋混勻，配置成1.0 mg/mL的標準儲備液，于-20℃冰箱中保存。

2.2.2 混合標準中間液

吸取標準儲備液200μL置于10 mL棕容量瓶中，用甲醇稀釋配置成混合標準中間液。其中四種物質的濃度均為200.0μg/mL，于4℃以下冰箱中保存。

2.2.3 混合標準工作液

精密吸取2.2.2的混合標準中間液用甲醇稀釋至樣品檢測的濃度。標準曲線的最終濃度為5.0、10.0、2 0.0、50.0、100.0μg/mL。

2.3 色譜儀器條件的單因素實驗

影響液相色譜出峰時間、峰形和分離度的因素主要有色譜柱種類、柱溫、流動相配比和流速等。通過單因素分別考察色譜柱種類、柱溫、流動相配比和流速對四種非法添加物的分離效果和峰形的影響。色譜柱對分離效果和峰形的影響：分別使用Agilent Eclipse Plus C18（5μm，4.6×250 mm）和GL Sciences Inc.InertSustain C18（5μm，4.6×250 mm）對鹽酸西布曲明等4種物質進行分離效果的比較；色譜柱柱溫對分離效果和峰形的影響：考察不同柱溫（25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃）對4種非法添加物質分離效果；流動相不同配比對分離效果和峰形的影響：流動相A，乙腈；流動相B，0.02 mol/L乙酸銨水溶液（用乙酸調pH至4.0±0.2），比較不同流動相配比B：A為41：59、44：56、47：53、50：50、53：47的分離效果；流速的選擇對分離效果和峰形的影響：流速分別選擇0.5、0.8、1.0、1.2 mL/min四個流速進行比較。

2.4 質譜色譜條件

液相條件：色譜柱，InertSustain C18（2μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫40℃；進樣體積5.0μL；流動相A為0.01 mol/L乙酸銨（0.1%甲酸），B為乙腈；流速0.3 mL/min。洗脫梯度見表2。酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸西布曲明在正離子模式下進行全掃面和單離子掃描得到母離子并優化碎裂電壓，使母離子的豐度達到最優，再進行子離子掃描。選擇3～4個特征碎片離子對，優化相對應的碰撞電壓，并選取豐度相對較高的子離子作為定量離子。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure

2.5 方法學考察

標準曲線的繪制：以標準品質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，以峰面積（Y，mAu×s）為縱坐標繪制標準曲線。

重復性試驗和回收試實驗：選取減肥膠囊，減肥茶的空白基質樣品，每種樣品稱1 g，分別添加低、中、高3個水平混合標準溶液，每個添加水平測定做6次平行實驗。

3 試驗結果

3.1 液相色譜條件的優化

3.1.1 色譜柱的選擇

在同一流動相條件下，Agilent Eclipse Plus C18色譜柱上4種物質均能實現很好的分離，而且峰形更尖銳，靈敏度更高，比補充檢測方法［18］中峰分離度更好。而在GL Sciences Inc.InertSustain C18的條件下，酚酞和鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明完全重合成一個峰，分離效果很差，且峰寬都較大，有拖尾現象。因此，選擇Agilent Eclipse Plus C18（5μm，4.6×250 mm）作為分離色譜柱，4種物質的高效液相色譜圖見圖1。

3.1.2 色譜柱柱溫的選擇

柱溫升高可以降低流動相粘度、提高傳質效率、縮短分析時間，但溫度太高影響色譜柱的使用壽命。由于4種物質中酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明分離效果并不理想，因此考慮溫度對分離度的影響。實驗發現，同一色譜條件下，隨著溫度的升高，酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明和鹽酸N-單去甲基西布曲明的分離度越來越好。但是當溫度達到55℃時，基線波動開始增大，在濃度較低時對檢測結果有影響，因此選擇50℃的柱溫，分離效果最好，基線最穩，圖譜見圖1。

3.1.3 流動相配比選擇

試驗比較流動相A，乙腈；流動相B，0.02 mol/L乙酸銨水溶液（用乙酸調pH至4.0±0.2）不同配比分離效果。當乙腈比例為44時，4種物質集中在一起，無法分離。隨著乙腈比例的增大，4種物質的分離度逐漸增大。當流動相B：A比例為47：53等度洗脫時，此條件下4種物質明顯分開，分離度增大，且出峰時間穩定。最終選擇乙酸銨水溶液：乙腈為47：53，圖譜見圖1。

圖1 225 nm下酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸西布曲明的高效液相色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram of phenolphthalein，N-didesmethyl sibutramine hydrochloride，didesmethyl sibutramine，sibutratmine hydrochloride monohydrate

3.1.4 流速的選擇

流速分別選擇四個不同流速進行試驗，發現流速為0.5 mL/min、0.8 mL/min時4種物質出峰順序為鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、酚酞、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸西布曲明，酚酞出峰在兩種衍生物出峰中間且峰與峰相互連接，分離度不好液相色譜難以定量。當流速為1.0 mL/min時4種物質出峰順序為酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸西布曲明，酚酞最先出峰且4種物質明顯分開，分離度增大。當流速為1.2 mL/min時4種物質雖都能分開但分離度不如1.0 mL/min時，所以流速選擇1.0 mL/min。

3.1.5 色譜峰的定性

酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸西布曲明的高效液相色譜最大吸收波長見圖2。通過將樣品圖譜與4種非法添加藥物標準品的光譜比對進行排除雜質的干擾進行確證。

圖2 酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸西布曲明的高效液相色譜光譜圖Fig.2 Wavelength spectrograms of phenolphthalein，N-didesmethyl sibutramine hydrochloride，didesmethyl sibutramine，sibutrat?mine hydrochloride monohydrate on photodiode array detector

3.2 線性關系、方法檢出限及定量限

配制系列的混合標準溶液，得到線性回歸方程。結果表明，各目標化合物在線性范圍內線性關系良好；配制標準溶液混標，用空白基質溶液稀釋到適量濃度，以儀器3倍和10倍性噪比確定方法檢出限和方法定量限，結果見表3。

表3 4種非法添加物的線性關系Table 3 Linear relationship of four illegal additions

3.3 重復性和回收率

重復性和回收率試驗結果見表4。結果表明，三個不同添加水平的回收率在80.4%～104.6%，相對標準偏差在0.7%～9.5%，都控制在10%以內。說明該方法具有良好的準確度和精密度。均符合GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》中要求。

表4 4種非法添加物不同濃度添加水平回收率結果Table 4 Recovery results of four illegal additions at different concentrations

3.4 用液質方法進行確證

質譜參數：AJS-ESI電離源，正離子電離模式，監測模式：MRM。通過對4種非法添加物的離子對優化得到的多反應監測質譜參數見表5。液相中確認有非法添加物后，再通過液質儀器與標準物質的定量離子和定性離子進行對比，若定量離子和定性離子與標準物質一致，則該樣品確認含有該非法添加物。參考圖譜見圖3和圖4，分別為4種化合物的總離子流圖、定量離子和定性離子圖。

表5 4種非法添加物多反應監測質譜參數Table 5 Multi reaction monitoring mass spectrum parameters of four illegal additions

圖3 酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸西布曲明的總離子流圖Fig.3 Total ion current diagram of phenolphthalein，N-didesmethyl sibutramine hydrochloride，didesmethyl sibutramine，sibutrat?mine hyclrochloride monohydrate

圖4 酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸西布曲明的多反應監測質譜疊加圖及離子對比圖Fig.4 MRM mass spectrogram stack and ion contrast diagram of phenolphthalein，N-didesmethyl sibutramine hydrochloride，dides?methyl sibutramine，sibutratmine hydrochloride monohydrate

3.5 實際樣品分析

按照本研究中液相色譜法對市售30批次減肥類保健品進行分析，其中3批次檢測出與鹽酸西布曲明色譜峰出峰時間一致，對比液相光譜圖確定為鹽酸西布曲明，其含量極高，進一步稀釋樣品進行液質核對，此3批次確為鹽酸西布曲明。該方法可用于實際減肥類保健食品樣品的快速定性定量，大大提高了檢測效率。

4 討論

經過近兩年的保健食品檢測，減肥類保健品中檢出率較高的非法添加為酚酞和西布曲明及其衍生物，監督部門需要重點關注。本研究建立了一種利用高效液相色譜技術于15 min內同時檢測酚酞、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸西布曲明的檢測方法，并優化了質譜方法中的離子對。從研究試驗數據可以看出，各物質成分的線性關系良好，回收率均較高，展現出了分離能力強，靈敏度高，分析速度快，定量分析準等優點，可用于減肥類保健食品中非法添加化學藥物的定性篩查和定量檢測，為保健食品中減肥類非法添加監管提供檢測技術。然而本研究是一次性檢測4種物質，檢測物質數量稍少，今后的研究將增加檢測物質的數量，往高通量檢測方向上開展研究。