HPLC法測定丹參-紅花配方顆粒中5種成分的含量

杜少兵，王鵬飛，白吉慶，周慧慧，薛志鵬，高 速，李 菁，王小平，2

（1.陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712046）

丹參為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhizaBge.）的干燥根及根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性微寒，味苦，歸心、肝經(jīng)，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、涼血消癰，除煩安神的功效［1］。紅花為菊科植物紅花（Carthamus tinctoriusL.）的干燥管狀花，始載于《開寶本草》，味辛微苦、性溫，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛、解毒的功效，用于經(jīng)閉、痛經(jīng)、惡露不行、癥瘕痞塊、胸痹心痛等癥［2］。丹參-紅花藥對是經(jīng)典的活血化瘀相須藥對，兩藥配伍使用，一升一降，內(nèi)外通和，使行氣活血之功尤為顯著。有文獻表明，二藥合用祛瘀生新，除邪而不傷正，共奏活血通絡、祛瘀生新之功［3-4］。臨床上廣泛用于冠心病、心絞痛、心肌梗死、心肌缺血等心血管疾?。?-7］，且療效確切［8-10］。

中藥配方顆粒是以符合規(guī)范的中藥飲片為主要原材料，利用現(xiàn)代化技術對有效成分進行提取、分離以及濃縮，之后進行干燥處理、制成供中醫(yī)臨床配方使用的顆粒，具有便于調(diào)配、免煎、易服、攜帶方便、劑量準確等特點［11］。丹參-紅花配方顆粒的文獻研究較少，缺乏質(zhì)量控制與評價的方法?；诖耍驹囼灲PLC法測定丹參-紅花配方顆粒中5種（丹參素、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B）主要活性成分含量，為丹參-紅花配方顆粒的多指標質(zhì)量控制和全面的質(zhì)量評價提供科學數(shù)據(jù)。

1 儀器、試劑與試藥

1.1 儀器

Dionex Ultimate3000高效液相色譜儀（上海賽默飛世爾儀器有限公司）；Discovery DV215CD電子分析天平（瑞士賽多利斯集團）；Direct-Q 3UV純化水機（美國Millipore公司）；SFY-20A鹵素快速水分測定儀（蘇州市萊頓科學儀器有限公司）；KQ-300VDE超聲清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；HX-25電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）。

1.2 試劑與試藥

丹參采自山東省菏澤市鄄城縣，紅花采自新疆維吾爾自治區(qū)塔城市裕民縣，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學白吉慶副教授鑒定均為正品。丹酚酸B對照品（批號：111562-201716，質(zhì)量分數(shù)≥99.8%），羥基紅花黃色素A對照品（批號：111637-201810，質(zhì)量分數(shù)≥93.1%）購自中國食品藥品檢定研究院；丹參素對照品（批號：DST170420-015，質(zhì)量分數(shù)≥98.0%）購自成都德思特生物技術有限公司；紫草酸對照品（批號：19053003，質(zhì)量分數(shù)≥99.8%）購自森嵐科技有限公司；迷迭香酸對照品（批號：BZP0004，質(zhì)量分數(shù)≥98.0%）購自江西佰草源生物科技有限公司；乙腈（色譜純），美國默克公司；其他試劑均為分析純；水為超純水（自制）。

2 方法

2.1 丹參-紅花配方顆粒樣品的制備

取丹參30 g，加320 mL水浸泡60 min，加入紅花10 g，溫浸120 min，放至室溫，過濾，濾渣加8倍量的水溫浸提取2次，每次120 min，濾液合并減壓濃縮后干燥，得干浸膏粉，粉碎過3號篩，以干浸膏粉-糊精（1：1，m/m）混勻，70%乙醇為潤濕劑，濕法制粒，整粒，即得丹參-紅花配方顆粒（20190808、20190822、20190830）。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：A為乙腈，B為0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～15 min，5%A；15～40 min，5%～10%A；40～130 min，10%～20%A；130～150 min，20%～23%A）；柱溫25℃；檢測波長288 nm；流速1 mL/min；進樣量為5μL。

2.2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取丹參素0.84 mg、羥基紅花黃色素A 0.67 mg、迷迭香酸0.58 mg、紫草酸0.36 mg、丹酚酸B 3.15 mg，置同一100 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

取本品顆粒適量，研細，精密稱取0.1 g的粉末，置錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理5 min。取出，放冷，加水補充減失質(zhì)量，搖勻，0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗

分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各5μL，按擬定色譜條件測定，記錄色譜圖。

2.2.5 線性關系考察

分別精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液1，2，5，8，10μL，按擬定色譜條件，注入液相色譜儀，記錄各對照品的峰面積。

2.2.6 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液3μL，按擬定色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄各待測成分的峰面積。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液3μL，按擬定色譜條件，分別于0、1、2、4、8、12、24 h進行測定，記錄各待測成分的峰面積。

2.2.8 重復性試驗

取同一批號樣品6份，按照“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液，按擬定色譜條件測定，各待測成分的峰面積，代入工作曲線計算其含量，以各成分含量的RSD值來評價方法的重復性。

2.2.9 加樣回收率試驗

取已知含量同一批號的丹參-紅花配方顆粒0.05 g，平行6份，分別精密加入適量的丹參素、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B對照品，按“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液，按擬定色譜條件測定，計算加樣回收率。

2.2.10 樣品的測定

分別稱取丹參-紅花顆粒3批適量，按“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液，按擬定色譜條件，進樣3 μL，記錄丹參素、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B的峰面積，計算其含量。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適用性試驗

結(jié)果顯示供試品色譜圖中，在與對照品色譜圖丹參素（峰1）、羥基紅花黃色素A（峰2）、迷迭香酸（峰3）、紫草酸（峰4）及丹酚酸B（峰5）相應位置上，均有相同保留時間，各成分的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按丹酚酸B峰計算應不低于6000，見圖1。

圖1 混標溶液和丹參-紅花配方顆粒HPLC色譜圖Fig.1 HPLCchromatogramsof mixed standard solution and Danshen-Honghua dispensing granule

3.2 線性關系考察

以對照品進樣量（ng）為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸。線性關系結(jié)果見表1，結(jié)果表明各待測成分在試驗濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

表1 各成分線性關系Table 1 Linear relationships of various constituents

3.3 精密度試驗

丹參素、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B峰面積的RSD（n=6）分別為2.55%、1.55%、2.74%、1.79%、1.77%，表明該儀器的精密度良好。

3.4 穩(wěn)定性試驗

丹參素、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B峰面積的RSD（n=6）分別為2.30%、2.49%、2.13%、2.74%、1.31%，表明供試品溶液中各待測成分24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.5 重復性試驗

丹參素、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B峰面積的RSD（n=6）分別為1.76%、1.50%、2.82%、2.75%、1.33%，表明該方法重復性良好。

3.6 加樣回收率試驗

由表2可知，該方法的回收率良好，表明試驗結(jié)果可靠。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Table 2 Results of recovery test

3.7 樣品的測定

樣品中丹參素、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B含量測定結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（mg/g）Table 3 Determination of five components in the sample

4 討論

現(xiàn)代研究表明，丹參的主要活性成分為親水性成分（丹參素、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B）和親脂成分［12］。而紅花的主要活性成分是查耳酮類化合物紅花黃色素，其中羥基紅花黃色素A是活性較高的成分［13］，其具有抗氧化、抗血栓、神經(jīng)保護、抑制炎癥因子的產(chǎn)生等藥理作用，而且可以改善因腦缺血再灌注引起的腦損傷［14-16］。所以本試驗選擇這5種活性成分為評價指標，為丹參-紅花配方顆粒質(zhì)量控制與評價提供參考。

本試驗采用二極管陣列檢測器對其進行全波長掃描，結(jié)果表明丹參素、紫草酸、迷迭香酸的最大吸收波長為280 nm，丹酚酸B的最大吸收波長為286 nm，羥基紅花黃色素A的最大吸收波長為403 nm，考察了不同波長下各成分的吸收情況，發(fā)現(xiàn)各成分在288 nm處均有中強吸收，基線穩(wěn)定，所得各個色譜峰的峰面積較高，且色譜峰分離度較好，故選用288 nm為檢測波長，便于該方法的廣泛地應用。本試驗考察乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水溶液、甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸水溶液等流動相系統(tǒng)，結(jié)果顯示以乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動相，峰形較對稱。通過對乙腈-0.2%磷酸水溶液流動相的洗脫方式進行比較，發(fā)現(xiàn)等度洗脫無法得到較好的分離度，故最終選用梯度洗脫。

本試驗以丹酚酸B、丹參素、紫草酸、迷迭香酸和羥基紅花黃色素A為指標，建立了HPLC法測定丹參-紅花配方顆粒中這5種成分的含量。該方法簡便、高效、準確、重復性好，對丹參-紅花配方顆粒進行了一定程度的質(zhì)量研究，為其后續(xù)研究提供技術參考。